細胞培養(yǎng)實戰(zhàn)中血清沉淀物等常見問題分析及經(jīng)驗分享

Q：培養(yǎng)液到底要不要加雙抗（青霉素&鏈霉素）？
A：雙抗不是細胞生長必需的。我們培養(yǎng)細胞時不常規(guī)使用抗生素，因為連續(xù)使用抗生素會促進抗生素耐藥性細胞株的產(chǎn)生，導致輕度污染持續(xù)存在。一旦將抗生素從培養(yǎng)液中去除，這種輕度污染最終將發(fā)展成為大規(guī)模污染。具體情況，可根據(jù)自己實驗室的環(huán)境，自行決定是否使用雙抗。

Q：細胞培養(yǎng)，能更換成其它種類的培養(yǎng)基嗎？
A：我們強烈建議最好使用細胞提供機構或細胞庫推薦的生長培養(yǎng)液。有些細胞可能會適應在不同培養(yǎng)基中生長，在做好保種的條件下，可以分出部分細胞做測試。

Q: 細胞在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)碎片如何處理？
A: 貼壁細胞在移除原培養(yǎng)液后，用 PBS 沖洗 2-3 遍；懸浮細胞離心移除原培養(yǎng)液后，加入 PBS 重懸，離心移除 PBS; 一般建議重復上述步驟 2-3 遍，用 800-1000rpm 離心 3-5 分鐘。

Q：細胞凍存能放在 -80℃ 保存嗎？
A：長期保存的細胞應當放在液氮（-196℃）中保存，短時間（一般 1 周-2 周）可以存放在 -80℃。

Q：培養(yǎng)瓶是用密封蓋好，還是用透氣蓋好？
A：都可以。只是在使用密封蓋培養(yǎng)瓶時，瓶蓋旋至約 2/3，不要完全擰緊，預留約 1/3 以便細胞可以透氣；有些品牌的密封蓋培養(yǎng)瓶的瓶蓋上有適合位置指示標志。

Q:何謂 FBS,FCS,CS,HS?
A: Fetal bovine serum(FBS)和 Fetal Calf Serum(FCS)之間沒有區(qū)別，都是指胎牛血清；FCS 不是正規(guī)命名，盡量不使用。Calf Serum（CS）則是指小牛血清。Horse Serum(HS)則是指馬血清。

Q:血清中可能出現(xiàn)的沉淀物是什么？
A:基于多年的實驗研究，用于細胞培養(yǎng)的胎牛血清以及其它血清中可能會存在以下種類的沉淀物：
（1）纖維蛋白，它是經(jīng)常出現(xiàn)的較大的沉淀物，可以達到 1-2mm，可以用肉眼觀察到。因為血清都是在低溫下進行收集和快速處理的，一些纖維蛋白原（可溶性的形成絮狀纖維蛋白的前體）在處理過程中仍然處于溶解狀態(tài)，當經(jīng)過最后的過濾分裝后，就會在瓶中凝結出現(xiàn)纖維蛋白沉淀。
（2）磷酸鈣，它也是常見的一種沉淀物，通常會使血清出現(xiàn)渾濁，并且在 37℃ 培養(yǎng)的時候會增加。這種沉淀物在倒置顯微鏡下觀察像小黑點， 這些小黑點由于布朗運動看上去可以活動，因此經(jīng)常被誤認為是微生物污染。
（3）膽固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白質。他們也是血清中出現(xiàn)沉淀物的常見原因。

Q:血清中的沉淀物對細胞培養(yǎng)有什么影響？
A:（1）細胞生長，我們的試驗以及經(jīng)驗表明沉淀物不會影響細胞培養(yǎng)，我們的客戶以及其它血清生產(chǎn)商也證明了這一點。
（2）過濾，如果血清中出現(xiàn)大量的沉淀物，血清將很難過濾。一般說來，因為在血清生產(chǎn)工序中已經(jīng)過 100nm 或者 40nm 的過濾處理，并且經(jīng)過了嚴格的無菌檢測，因此不推薦再過濾用于細胞培養(yǎng) 的血清。在實驗室中沒有必要再過濾處理血清，在大規(guī)模的細胞培養(yǎng)中往往將血清直接加到培養(yǎng)基中一起 過濾。
（3）污染，磷酸鈣往往被誤認為微生物污染而引起爭端。研究者可能會在血清中觀察到一些絮狀的 沉淀，因此就會比較警覺的去做無菌試驗，將血清放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)幾天，結果可能會觀察到更多的絮狀 沉淀，因此就斷定血清被污染了。并且當研究者將血清樣品放在倒置顯微鏡下觀察時往往可以看到一些可 以運動的小黑點，因此就更加確認是血清被污染了。于是，研究者就會花費更多的時間和精力來和生產(chǎn)商 確認，但最終確定血清沒有被污染而只是沉淀。為了避免這些問題的發(fā)生，我們建議不要直接將血清放在 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察是否有菌，而是將血清加到瓊脂板上進行培養(yǎng)以觀察是否有細菌生長。另外，也可以進 行革蘭氏染色，在油鏡下觀察，以確認是否有污染。

Q:如何避免血清中沉淀物的出現(xiàn)？
A:首先要注意正確的血清解凍步驟，而且溶解過程中一定要每隔一段時間均勻而緩慢的搖動血清。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在下列情況下沉淀物可能增加，使用中應該盡量避免：
（1）熱滅活血清；
（2）在 37℃ 下培養(yǎng)血清；
（3）反復凍融；
（4）γ 射線照射；
（5）長期儲存在 2-8℃；
（6）在室溫下放置時間過長

Q:如何去除血清中的沉淀？
A:如想去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝到無菌離心管中，以  400g  離心，上清液即可直接加入到培養(yǎng)基 內(nèi)一起過濾。
注意：不要以過濾的方式去除這些絮狀沉淀物，因為這可能阻塞濾膜。