血清種類與產(chǎn)地知識(shí)技術(shù)解析

由于血清來源于動(dòng)物，且含有細(xì)胞培養(yǎng)中所需的各種營養(yǎng)（血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長(zhǎng)因子、激素、無機(jī)物等），這奠定了血清是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中最普遍的試劑的基礎(chǔ)。

 

目前血清采集地主要分布在以下國家：

 

市面上的牛血清產(chǎn)品名稱雖然五花八門，但根據(jù)其不同的特性，追其根本，大致可分為以下四種。根據(jù)牛的取血年齡可以區(qū)分：

 

胎牛血清

胎牛血清（Foetal Bovine Serum，簡(jiǎn)稱FBS）指的是取自未出生，母牛剖腹心臟穿刺采血得來的血清。

國產(chǎn)胎牛血清

國產(chǎn)胎牛血清（并無明確定義，但通常用此命名）指的是出生4-6小時(shí)，且未進(jìn)行哺乳（unsuckled）進(jìn)食的新生牛，有時(shí)還稱作國產(chǎn)新生牛血清。

新生牛血清

新生牛血清（Newborn Calf Serum，簡(jiǎn)稱NBCS，或稱小牛血清）指的是出生14天-3個(gè)月進(jìn)行取血的牛血清。

成年牛血清

成年牛血清（Adult Bovine Serum，簡(jiǎn)稱ABS）指的是取血時(shí)牛齡通常超過12個(gè)月的牛血清。

 

以上取血牛齡的差異主要是受當(dāng)?shù)貒�家畜牧業(yè)的發(fā)展及法規(guī)限制影響，因?yàn)榕Ｑ�多為畜牧業(yè)副產(chǎn)業(yè)，并未有專門為取血而養(yǎng)的牛。

 

 

幾種血清的比較：

 

 

項(xiàng)目	等級(jí)
提取血清體積/只牛	成年牛血清(5-8L) > 小牛血清 (2L) > 國產(chǎn)胎牛血清 (1L) > 胎牛血清 (0.5L)
培養(yǎng)細(xì)胞的效果	胎牛血清 > 國產(chǎn)胎牛血清 > 小牛血清 > 成年牛血清
價(jià)格	胎牛血清 > 國產(chǎn)胎牛血清 > 小牛血清 > 成年牛血清

 

這幾種不同牛齡血清所含的促細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促貼附因子、激素及其他活性物質(zhì)等組分與比例不同。常規(guī)來說，年齡越小的牛血清，細(xì)胞培養(yǎng)效果越好。胎牛血清培養(yǎng)效果好于新生牛，且因?yàn)樘ヅＮ催M(jìn)食過母乳，所以IgG含量低。故目前多數(shù)實(shí)驗(yàn)人員選擇的都是胎牛血清進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

 

 

胎牛血清成分已知的已有上千多種，以下為主要成分表：

 

 

成分	濃度	成分	濃度
蛋白和多肽	-	磷脂	0.7-3.0 mg/ml
白蛋白	20-50mg/ml	丙酮酸	2-10 ug/ml
胎球蛋白	10-20mg/ml	碳水化合物	-
纖連蛋白	1-10 ug/ml	葡萄糖	0.6-1.2 mg/ml
球蛋白	1-15 mg/ml	乳酸	0.5-2.0 mg/ml
α-抗胰蛋白酶	0.5-2.5 mg/ml	多胺	-
轉(zhuǎn)鐵蛋白	2-4 mg/ml	丁二胺,亞精胺	0.1-1.0 uM
生長(zhǎng)因子	-	尿素	170-300 ug/ml
EGF, PDGF, IGF-I, IL-1	1-100 ng/ml	無機(jī)物	-
氨基酸	0.01-1.0 uM	鈣，氯化物，鉀，磷	-
脂質(zhì)	-	激素	-
膽固醇	10 uM	胰島素	1-100 ng/ml
脂肪酸	0.1-1.0 uM	皮質(zhì)醇	10-200 nM
亞油酸	0.01-0.1 uM	維生素	10 ng-10 ug/ml

 

 

以下是我們?yōu)槟�總結(jié)的血清相關(guān)的知識(shí)點(diǎn)：

 

1. 血清的顏色如何？

為何有的胎牛血清顏色偏紅，而有的偏黃？是因?yàn)樘ヅＱ�清顏色是由血紅蛋白（鮮紅）和膽紅素（黃）決定的，主要是受血紅蛋白影響。血紅蛋白含量很低時(shí)，含少量膽紅素，呈淡黃或金黃。血紅蛋白含量高時(shí)，會(huì)呈現(xiàn)淡紅色。

需要長(zhǎng)期保存的血清必須儲(chǔ)存于-20℃冰箱（未開封血清有效期為5年）。若存放于4℃，請(qǐng)勿超過1個(gè)月，若一次無法用完一瓶，建議將血清無菌分裝并冷凍。

 

2. 血清如何解凍？

血清解凍需采用逐步解凍法：將血清從-20℃冰箱放入4℃冰箱中溶解一天，然后移入室溫，待全部溶解后再分裝。在溶解過程中需不斷輕輕搖晃均勻（小心勿造成氣泡），減少沉淀生成。切勿直接將血清從-20℃轉(zhuǎn)入37℃解凍，這樣因溫差較大易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)并出現(xiàn)沉淀。

 

3. 使用前是否需要過濾？

本公司血清在ISO 13485認(rèn)證的廠房中生產(chǎn)，經(jīng)過3次0.1 μm過濾，出廠經(jīng)過檢測(cè)并且會(huì)使用三種以上的細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)測(cè)試及無菌檢測(cè)，污染幾率非常非常非常低（重要的事情說三遍）。通常細(xì)胞污染有非常多的可能性，根據(jù)協(xié)助使用者進(jìn)行分析檢測(cè)，結(jié)果表明絕大部分都是因人為操作失誤導(dǎo)致污染。因此買來的血清不需要再次進(jìn)行過濾。

下圖為人肉眼和光學(xué)顯微鏡所能觀察到的微粒大小。由于我們的血清是經(jīng)過3次0.1 μm過濾，因此若肉眼可以觀察到異物時(shí)，可以考慮：

• 是否血清溶解后蛋白質(zhì)凝集
• 是否操作時(shí)導(dǎo)入污染物

 

4. 為什么血清中會(huì)有沉淀生成，主要成分是什么，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)有什么影響？

血清中沉淀主要有：纖維蛋白（絮狀沉淀），胎球蛋白，脂蛋白，冷凝集素，玻連蛋白，磷酸鈣（顯微鏡下小黑點(diǎn)沉淀），膽固醇等。

原因：造成沉淀的主要原因是溫度的改變。熱滅活，反復(fù)凍融，長(zhǎng)期儲(chǔ)存于2-8℃或者室溫。

預(yù)防：非必要，不用熱滅活；避免反復(fù)凍融；-20℃保存；4℃全融（期間間斷搖晃均勻）；2000 rpm離心5分鐘(不建議用0.2 μm濾膜過濾），取上清使用。

根據(jù)多年的實(shí)驗(yàn)研究顯示，血清中的沉淀物不會(huì)影響細(xì)胞培養(yǎng)。ATCC（美國菌種保藏中心）實(shí)驗(yàn)也是相同的結(jié)果。

美國ATCC：https://www.atcc.org/

 

5. 黑膠蟲是來源于血清嗎？

目前科學(xué)界對(duì)黑膠蟲的身份并無定論, 通常是顯微鏡下觀察到密密麻麻的小黑點(diǎn)在培養(yǎng)基中自主游動(dòng)，就稱為黑膠蟲污染。

本公司技術(shù)服務(wù)部 “Dr.Cell” 目前檢測(cè)的數(shù)十個(gè)所謂“黑膠蟲”樣本，其中62%為細(xì)菌（如Sphingomonas paucimobilis，Blastomonas natatoria strain），38%為支原體（如：Mycoplasma hyorhinis，Mycoplasma pulmonis strain）。

黑膠蟲在鏡下的典型特征呈卵圓狀、球狀、桿狀等，可引起細(xì)胞生長(zhǎng)遲緩或裂解凋亡。

目前沒有充分的數(shù)據(jù)表明黑膠蟲來源于血清，因?yàn)槠涑叽邕h(yuǎn)大于血清過濾時(shí)所用的0.1微米(μm)濾膜。建議各位老師通過使用三抗（Cat#: C3422-0100）外加支原體處理試劑（Cat#: 03-038-1B）嘗試殺滅黑膠蟲。

 

6. 血清存在批間差嗎？

答案是毋庸置疑的，因?yàn)檠�清來源于�?dòng)物，其組成成分有1000種左右，且血清組成及含量常隨供血?jiǎng)游锏男詣e、年齡、生理?xiàng)l件和營養(yǎng)條件不同而異。每個(gè)批號(hào)的組分和百分比含量都是不固定的，所以批間差異是存在的。

建議先進(jìn)行批號(hào)測(cè)試，篩選出合適批號(hào)，購買半年甚至一年以上的用量，避免批間差造成實(shí)驗(yàn)波動(dòng)（胎牛血清在-20℃保存可達(dá)5年）。

 

Tips：

如果要除去血清中的沉淀，可以將血清分裝至無菌離心管中，400g 離心，留上清即可。由于濾膜容易被沉淀堵塞，因此不建議用過濾的方法。

沉淀不是檢驗(yàn)血清的硬指標(biāo)，但為了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確、實(shí)驗(yàn)美觀、實(shí)驗(yàn)便利，還是應(yīng)該盡量減少沉淀的產(chǎn)生。掌握正確的血清解凍、使用方法，再加上一款品質(zhì)穩(wěn)定的優(yōu)秀血清，對(duì)于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來說，至關(guān)重要。

正確的使用方法與優(yōu)質(zhì)的血清，二者缺一不可。

 

Reference

【1】Didier Raoult, Patricia Renesto et al. PLoS Pathogens. 2008 Feb., 4(2): e41
 

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