小鼠II型肺泡上皮細(xì)胞的分離及流式分選方法

在過去的幾年里，肺泡II型上皮細(xì)胞(AECII)在肺免疫調(diào)節(jié)的各個(gè)方面的貢獻(xiàn)越來越被認(rèn)識。AECII已被證明參與炎癥氣道中細(xì)胞因子的產(chǎn)生，甚至在感染和T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫中作為抗原提呈細(xì)胞。


圖1.肺泡上皮由兩種不同的細(xì)胞類型組成，肺泡I型和II型細(xì)胞

許多關(guān)于AEC II功能的研究是使用小鼠或人肺泡上皮細(xì)胞系進(jìn)行的。使用細(xì)胞系當(dāng)然提供了一系列的好處，例如可獲得大量的細(xì)胞進(jìn)行廣泛的分析。然而，使用原代小鼠AECII可以更好地研究其在感染或自身免疫炎癥等復(fù)雜過程中的作用。原代小鼠AECII可以直接從患有這種呼吸條件的動(dòng)物中分離出來，這意味著它們已經(jīng)受到了在分析環(huán)境中發(fā)揮作用的所有額外外部因素的影響。例如，可以從感染甲型流感病毒的小鼠鼻內(nèi)分離出AECII，甲型流感病毒主要以這些細(xì)胞為目標(biāo)進(jìn)行復(fù)制。重要的是，通過從健康小鼠分離的AECII進(jìn)行體外感染實(shí)驗(yàn)，可以進(jìn)一步深入對感染后細(xì)胞反應(yīng)的研究。

該原代小鼠AECII分離方案是基于小鼠肺的酶解，然后用CD11c、CD11b、F4/80、CD19、CD45和CD16/CD32特異性抗體標(biāo)記細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選，AECII確定為未標(biāo)記和SSC high細(xì)胞群。

肺細(xì)胞的分離方法
（1）CO2 處死小鼠。注意:不要脫頸處死小鼠，否則會(huì)損傷氣管，后續(xù)再進(jìn)行肺泡灌洗則不能成功；確保痛覺反射的喪失。向小鼠噴上適量乙醇，沿腹中線開腹并小心取出腹膜。
（2）割開小鼠的左右頸靜脈和腎動(dòng)脈放血，清除組織流動(dòng)的血液；小心穿刺取出橫膈膜，切掉肋骨，露出心臟和肺。要特別小心，不要損傷肺。
（3）用26G針頭和10ml注射器經(jīng)右心室灌注10ml冷的PBS至肺變白無血。肺部會(huì)變白。減少紅血球的數(shù)量對于最終ATII細(xì)胞的產(chǎn)量和純度是重要的。
（4）切掉唾液腺，露出氣管。在氣管處通過22G留置針固定導(dǎo)管。（如果需要，在下一步之前，可以通過插入氣管的導(dǎo)管用PBS或培養(yǎng)基沖洗肺部，制備支氣管肺泡灌洗液樣本。）
（5）使用2ml注射器，將2ml的預(yù)先恢復(fù)至37℃的dispase酶通過導(dǎo)管注入肺，使所有肺葉充分?jǐn)U張。將注射器更換為1毫升的注射器，其中含有0.5ml的液化瓊脂糖，也注入肺中。將注射器留在導(dǎo)管上，防止瓊脂糖回流，立即用實(shí)驗(yàn)室紙巾和冰塊覆蓋肺部，冷卻幾分鐘。
（6）移除紙巾、冰塊、注射器和導(dǎo)管，切除肺、心臟和胸腺。用PBS沖洗肺，取出心臟、胸腺和剩余的氣管。將肺放入2ml dispase酶中，室溫孵育45分鐘。
（7）將肺從dispase酶中取出，轉(zhuǎn)移到7ml含有抗CD16 /32抗體(1 μg/ml)和100 μl DNase的DMEM培養(yǎng)基中。用鑷子將肺組織剪碎，室溫200 rpm孵育10分鐘。如果需要，細(xì)胞懸液可以在4°C保存，直到下一步。
（8）先用100 μm的細(xì)胞篩網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，再用70 μm、48 μm和30 μm的篩網(wǎng)進(jìn)行過濾。將濾液收集到試管中，160 x g 、4°C離心15 min，棄上清液。
（9）將細(xì)胞重懸于2ml紅細(xì)胞溶解緩沖液中(0.15 M NH4Cl, 0.01 M KHCO3, 0.1 mM EDTA, pH 7.2)，并加入13 ml DMEM培養(yǎng)基快速終止溶解。160 x g、4°C離心12min，棄上清即獲得肺泡上皮細(xì)胞。

流式分選II型肺泡上皮細(xì)胞
 
圖2.通過陰性選擇流式細(xì)胞術(shù)分離小鼠AECII的門控策略

當(dāng)從健康小鼠的肺細(xì)胞懸液分選AECII門通常會(huì)占所有事件的42±10%。當(dāng)使用患有呼吸道疾病(如病毒感染)的小鼠時(shí)，這一比例會(huì)明顯降低，因?yàn)樽畛醯募?xì)胞懸浮液將包含相當(dāng)高比例的淋巴細(xì)胞和其他招募到呼吸道的免疫細(xì)胞。（A）表示細(xì)胞分選的邏輯概述；（B）肺細(xì)胞懸液的典型圖；（C）分選后細(xì)胞的純度。關(guān)于分選AECII的存活率，發(fā)現(xiàn)流式分選后的細(xì)胞存活率約為90%。這種高比例的活細(xì)胞可以直接進(jìn)行功能分析，也可以對分離的原代小鼠AECII進(jìn)行短期培養(yǎng)。