細(xì)胞活性分析與增殖測(cè)定詳解

 

細(xì)胞活性分析

與增殖測(cè)定

 

小編前陣子去學(xué)了CPR，第一個(gè)步驟就是要先確認(rèn)倒在那里的人是不是還…活著。
先生先生，你怎么了？（拍拍肩膀）
讓小編開(kāi)始好奇，我的細(xì)胞“要怎么判斷他們是死是活呢？它們活的好嗎?”

 

 

我們可以簡(jiǎn)單將分析細(xì)胞活力和增殖測(cè)定的方法分成5大類(lèi)：

1. DNA合成增殖試驗(yàn)

2. 代謝增殖測(cè)定

3. 化學(xué)發(fā)光細(xì)胞活性測(cè)定

4. 熒光染料增殖試驗(yàn)

5. 臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)

以下簡(jiǎn)單介紹這些分類(lèi)的幾種常見(jiàn)實(shí)驗(yàn)方式吧！

 

 

01

 DNA合成增殖試驗(yàn) 

✦  +

 BrdU檢測(cè)法 

BrdU結(jié)構(gòu)長(zhǎng)的跟胸腺嘧啶核苷（Thymine）很像，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)通過(guò)增殖周期-S期（DNA半保留復(fù)制期）時(shí)，BrdU可魚(yú)目混珠進(jìn)入新合成的DNA中，因此在加入BrdU后分裂增殖的細(xì)胞都會(huì)帶有含BrdU的DNA，可通過(guò)抗BrdU單克隆抗體檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)并計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間；但BrdU單克隆抗體太大，無(wú)法直接與DNA雙股螺旋上的BrdU結(jié)合（胖子上不了螺旋樓梯），所以實(shí)驗(yàn)過(guò)程需要將DNA部份變性，使雙股部份解開(kāi)成單股才能順利檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)步驟較繁瑣復(fù)雜。

 

 

✦  +

 EdU 檢測(cè)法 

EdU原理跟BrdU檢測(cè)法很像，都是代替胸腺嘧啶滲入正在復(fù)制的DNA中；但能與EdU共軛反應(yīng)的染料分子僅為BrdU抗體的1/500,在細(xì)胞內(nèi)更容易擴(kuò)散，所以不需要變性處理，有效縮減實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間，更能避免樣品損傷，反應(yīng)更真實(shí)的細(xì)胞增殖狀況。

 

偵測(cè)方法：ICC、IHC、FACS、ELISA

 

 

 

02

 代謝增殖測(cè)定 

✦  +

 MTT檢測(cè)法 

活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶,能使額外添加的MTT還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶,并沉積在細(xì)胞中，死細(xì)胞則無(wú)現(xiàn)象；再利用二甲基亞砜（DMSO）溶解MTT藍(lán)紫色結(jié)晶（Formazan），即可利用酶標(biāo)儀測(cè)定光吸收值，并計(jì)算出活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT藍(lán)紫色結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。

 

 

✦  +

 XTT檢測(cè)法 

與MTT原理相似，皆是利用添加物與活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)，并利用酶標(biāo)儀測(cè)定產(chǎn)物光吸收值；不同于MTT法的是，XTT反應(yīng)產(chǎn)物為水溶性橙黃色物，不需經(jīng)過(guò)二甲基亞砜（DMSO）溶解步驟，即可直接測(cè)定光吸收值，操作較MTT方便快速。

 

 

 

03

 化學(xué)發(fā)光細(xì)胞活性測(cè)定 

✦  +

 ATP發(fā)光法 

原理是利用外源的螢火蟲(chóng)熒光素（Luciferin）與熒光素酶（Luciferase），以細(xì)胞內(nèi)含的ATP為能量來(lái)源，發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生生物冷光；而ATP是活細(xì)胞的必含物質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)含量恒定，因此可通過(guò)監(jiān)測(cè)冷光光度，來(lái)對(duì)應(yīng)ATP含量并判斷細(xì)胞增殖狀況。

 

 

 

04

 熒光染料增殖試驗(yàn) 

✦  +

 CFSE檢測(cè)法 

CFSE是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料，不具有熒光性質(zhì)，而具有細(xì)胞膜通透性，能夠自由進(jìn)入細(xì)胞；當(dāng)CFSE擴(kuò)散穿過(guò)細(xì)胞膜，會(huì)與細(xì)胞內(nèi)酯酶產(chǎn)生水解反應(yīng)而發(fā)出綠色熒光，這些帶熒光的CFSE會(huì)進(jìn)一步與細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合，形成穩(wěn)定的胞內(nèi)熒光蛋白。每當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行分裂增殖，胞內(nèi)熒光蛋白會(huì)被平均分配到下一代細(xì)胞中，因此細(xì)胞熒光強(qiáng)度會(huì)隨著增殖代數(shù)增加而不斷的降低，可用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步偵測(cè)分析得出細(xì)胞分裂增殖的情況。

 

 

 

05

 臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù) 

✦  +

 臺(tái)盼藍(lán)（Trypan Blue）計(jì)數(shù)法 

臺(tái)盼藍(lán)是一種藍(lán)色染料，無(wú)法通過(guò)結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部；但細(xì)胞死后，喪失細(xì)胞膜穩(wěn)定性，臺(tái)盼藍(lán)會(huì)進(jìn)入細(xì)胞將細(xì)胞染成藍(lán)色，因此在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，被常規(guī)的搭配自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或血球計(jì)數(shù)板應(yīng)用于區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。

 

 

 

當(dāng)然，科技日新月異，
有越來(lái)越多更精確的實(shí)驗(yàn)方法等著大家去學(xué)習(xí)研究。
您實(shí)驗(yàn)室都在用什么方法測(cè)定細(xì)胞活性呢?