小鼠腸上皮淋巴細(xì)胞的分離、鑒定及體外培養(yǎng)
腸道免疫簡介 腸道是我們熟知的重要消化器官，主要執(zhí)行消化、吸收、排毒功能，事實(shí)上腸道也是機(jī)體最大的免疫器官，還具有免疫防衛(wèi)和神經(jīng)調(diào)節(jié)功能。那么腸道是如何執(zhí)行免疫功能的呢？首先，我們要知道腸道的免疫功能是由黏膜免疫系統(tǒng)執(zhí)行的。黏膜免疫系統(tǒng)與外部世界密切接觸，包括微生物群、病原體和環(huán)境抗原，這需要對免疫反應(yīng)進(jìn)行微調(diào)，使對病原體的有效反應(yīng)，同時(shí)保持對無害刺激的耐受性。粘膜免疫系統(tǒng)有機(jī)體70%以上的免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞等，集中在腸道，有70%以上的免疫球蛋白A，由腸道制造，用來保護(hù)腸道。
圖1 小鼠腸黏膜免疫系統(tǒng)構(gòu)成
粘膜腸上皮細(xì)胞由單層腸道上皮細(xì)胞組成，它們對營養(yǎng)吸收至關(guān)重要，并為有害物質(zhì)提供屏障。在粘膜單層柱狀上皮細(xì)胞之間、粘膜上皮細(xì)胞的基底膜上，存在著上皮淋巴細(xì)胞（Intestinal intraepithelial lymphocyte, IEL）。平均每100個(gè)腸上皮細(xì)胞之間就有10-20個(gè)IEL,80%以上的IEL為CD8+T淋巴細(xì)胞；IEL能以非MHC限制的方式直接識別未加工的抗原并發(fā)揮溶細(xì)胞活性，是機(jī)體早期抗感染的重要方式。
IEL可以根據(jù)TCR受體的表達(dá)譜分為以下幾類：TCRab、TCRgd、TCR-,具體分類見下圖：
（1）脫頸處死小鼠，噴適量酒精于腹部，開腹暴露腸道。（2）滴適量 Buffer 1（5% RPMI1640 + 5% FBS + 10 mM HEPES）潤濕腹腔，將腸道整體向上推翻，找到直腸。由直腸至胃，自下而上分離腸管和系膜等結(jié)締組織。剪取胃下至回盲部上端的小腸，兩次對折浸入 5 mL Buffer1中。（3）小腸放入培養(yǎng)皿內(nèi)并等分。在 Buffer 1 潤濕的擦拭布上除去脂肪和淋巴結(jié)并剖開。在含有Buffer 1的培養(yǎng)皿中依次清洗小腸，清洗干凈后將小腸剪成 1 cm 片段浸入25 mL Buffer 1中。（4） 取材全部結(jié)束后，每管加入 1 mM DTT，搖床 37℃，200 rmp，消化 20 min。（5）消化結(jié)束后再次離心，4℃，600 rmp，瞬離 30 s。其目的是使未消化徹底的組織沉淀在底部，保證過濾順暢。離心結(jié)束后用 100 μm 濾網(wǎng)并收集上清。（6）剩余組織每管加入 25 mL Buffer 2（ RPMI1640+25 mM EDTA+ 20 mM HEPES）繼續(xù)消化。搖床 37℃，200 rmp，30 min。（7）第二次消化結(jié)束后先用渦旋儀劇烈地漩渦兩次，再次離心，4℃ 600 rmp，30 s。（8）收集兩次消化獲得的上清混勻并進(jìn)行 4℃離心，2000 rmp，4 min。（9）每管加入10 mL 44%的分離液，離心，2000 rmp，20 min升6降0。（10）收集底部沉淀并加入 25 mL Buffer 1 洗一遍，4℃，1500 rmp，5 min，棄上清。此時(shí)獲得的細(xì)胞即為我們所需的腸上皮淋巴細(xì)胞。
圖3 小鼠回腸解剖方法展示
小鼠腸上皮淋巴細(xì)胞純度及亞群鑒定
圖 4 小鼠腸上皮淋巴細(xì)胞分離后細(xì)胞純度及活性鑒定
上文我們已經(jīng)展示了小鼠腸上皮淋巴細(xì)胞IEL的分類，下面我們用流式細(xì)胞術(shù)詳細(xì)展示各亞群的圈門策略。小鼠小腸中提到的IEL亞群一般為TCRγδ+ CD4-CD8αα+ (TCRγδCD8αα), TCRαβ+CD4-CD8αα+ (TCRαβ CD8αα), TCRαβ+ CD4-CD8αβ+(TCRαβ CD8αβ), TCRαβ+ CD4+CD8α-(TCRαβ CD4) 和 TCRαβ+ CD4+CD8αα+ (TCRαβ DP). TCRαβ CD8αβ 和TCRαβ CD4 IEL通常被認(rèn)為是組駐留記憶T細(xì)胞，在抗原暴露后會遷移到上皮細(xì)胞，相反，前兩種亞型通常被認(rèn)為是非傳統(tǒng)的或者先天T細(xì)胞，它們直接從胸腺遷移到腸上皮或者經(jīng)歷選擇性原位擴(kuò)張后，組成性地填充腸上皮。
圖 5 小鼠腸上皮淋巴各亞群細(xì)胞圈門策略
小鼠腸上皮淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng)
IEL單獨(dú)體外培養(yǎng)很容易死亡，IL-15可以短期內(nèi)維持其活性，而IL-15/IL-15R復(fù)合體更加有效。如果需要長期培養(yǎng)，則需要在有多種細(xì)胞因子的情況下進(jìn)行TCR刺激。
短期培養(yǎng)：
細(xì)胞鋪板，106細(xì)胞重懸于96孔板中，并加入20 ng/mL的小鼠IL-15/IL-15R復(fù)合物重組蛋白使其終體系為200μL。37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中可維持1-3天。
長期培養(yǎng)：（1）取anti-mouse CD3ε, clone 145-2C11置于96孔圓底板上(1μg/mL，每孔50μL）， 37℃ 孵育2小時(shí)或4℃ 過夜包被。然后用無菌PBS洗滌3次。（2）將IEL以5×105/ml重新懸浮96孔板中，并加入以下細(xì)胞因子：IL-2（10 IU/mL）、IL-3（100 IU/mL）、IL-4（100 IU/mL），IL-3（100 IU/mL），IL-4（100 IU/mL），和可溶性的IL-15（100 ng/mL）。（3）200μL體系,37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。（4）洗滌細(xì)胞兩次，1×105每孔重懸于含IL-2（10 IU/mL）的培養(yǎng)基中。（5）每隔3-4天更換新鮮的含IL-2的培養(yǎng)基。
說明：本內(nèi)容由發(fā)布者創(chuàng)建和發(fā)布，如涉侵權(quán)，請聯(lián)系發(fā)布者處理。本內(nèi)容僅代表發(fā)布者觀點(diǎn)，不代表平臺立場。
圖1 小鼠腸黏膜免疫系統(tǒng)構(gòu)成
粘膜腸上皮細(xì)胞由單層腸道上皮細(xì)胞組成，它們對營養(yǎng)吸收至關(guān)重要，并為有害物質(zhì)提供屏障。在粘膜單層柱狀上皮細(xì)胞之間、粘膜上皮細(xì)胞的基底膜上，存在著上皮淋巴細(xì)胞（Intestinal intraepithelial lymphocyte, IEL）。平均每100個(gè)腸上皮細(xì)胞之間就有10-20個(gè)IEL,80%以上的IEL為CD8+T淋巴細(xì)胞；IEL能以非MHC限制的方式直接識別未加工的抗原并發(fā)揮溶細(xì)胞活性，是機(jī)體早期抗感染的重要方式。
IEL可以根據(jù)TCR受體的表達(dá)譜分為以下幾類：TCRab、TCRgd、TCR-,具體分類見下圖：
（1）脫頸處死小鼠，噴適量酒精于腹部，開腹暴露腸道。（2）滴適量 Buffer 1（5% RPMI1640 + 5% FBS + 10 mM HEPES）潤濕腹腔，將腸道整體向上推翻，找到直腸。由直腸至胃，自下而上分離腸管和系膜等結(jié)締組織。剪取胃下至回盲部上端的小腸，兩次對折浸入 5 mL Buffer1中。（3）小腸放入培養(yǎng)皿內(nèi)并等分。在 Buffer 1 潤濕的擦拭布上除去脂肪和淋巴結(jié)并剖開。在含有Buffer 1的培養(yǎng)皿中依次清洗小腸，清洗干凈后將小腸剪成 1 cm 片段浸入25 mL Buffer 1中。（4） 取材全部結(jié)束后，每管加入 1 mM DTT，搖床 37℃，200 rmp，消化 20 min。（5）消化結(jié)束后再次離心，4℃，600 rmp，瞬離 30 s。其目的是使未消化徹底的組織沉淀在底部，保證過濾順暢。離心結(jié)束后用 100 μm 濾網(wǎng)并收集上清。（6）剩余組織每管加入 25 mL Buffer 2（ RPMI1640+25 mM EDTA+ 20 mM HEPES）繼續(xù)消化。搖床 37℃，200 rmp，30 min。（7）第二次消化結(jié)束后先用渦旋儀劇烈地漩渦兩次，再次離心，4℃ 600 rmp，30 s。（8）收集兩次消化獲得的上清混勻并進(jìn)行 4℃離心，2000 rmp，4 min。（9）每管加入10 mL 44%的分離液，離心，2000 rmp，20 min升6降0。（10）收集底部沉淀并加入 25 mL Buffer 1 洗一遍，4℃，1500 rmp，5 min，棄上清。此時(shí)獲得的細(xì)胞即為我們所需的腸上皮淋巴細(xì)胞。
圖3 小鼠回腸解剖方法展示
小鼠腸上皮淋巴細(xì)胞純度及亞群鑒定
圖 4 小鼠腸上皮淋巴細(xì)胞分離后細(xì)胞純度及活性鑒定
上文我們已經(jīng)展示了小鼠腸上皮淋巴細(xì)胞IEL的分類，下面我們用流式細(xì)胞術(shù)詳細(xì)展示各亞群的圈門策略。小鼠小腸中提到的IEL亞群一般為TCRγδ+ CD4-CD8αα+ (TCRγδCD8αα), TCRαβ+CD4-CD8αα+ (TCRαβ CD8αα), TCRαβ+ CD4-CD8αβ+(TCRαβ CD8αβ), TCRαβ+ CD4+CD8α-(TCRαβ CD4) 和 TCRαβ+ CD4+CD8αα+ (TCRαβ DP). TCRαβ CD8αβ 和TCRαβ CD4 IEL通常被認(rèn)為是組駐留記憶T細(xì)胞，在抗原暴露后會遷移到上皮細(xì)胞，相反，前兩種亞型通常被認(rèn)為是非傳統(tǒng)的或者先天T細(xì)胞，它們直接從胸腺遷移到腸上皮或者經(jīng)歷選擇性原位擴(kuò)張后，組成性地填充腸上皮。
圖 5 小鼠腸上皮淋巴各亞群細(xì)胞圈門策略
小鼠腸上皮淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng)
IEL單獨(dú)體外培養(yǎng)很容易死亡，IL-15可以短期內(nèi)維持其活性，而IL-15/IL-15R復(fù)合體更加有效。如果需要長期培養(yǎng)，則需要在有多種細(xì)胞因子的情況下進(jìn)行TCR刺激。
短期培養(yǎng)：
細(xì)胞鋪板，106細(xì)胞重懸于96孔板中，并加入20 ng/mL的小鼠IL-15/IL-15R復(fù)合物重組蛋白使其終體系為200μL。37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中可維持1-3天。
長期培養(yǎng)：（1）取anti-mouse CD3ε, clone 145-2C11置于96孔圓底板上(1μg/mL，每孔50μL）， 37℃ 孵育2小時(shí)或4℃ 過夜包被。然后用無菌PBS洗滌3次。（2）將IEL以5×105/ml重新懸浮96孔板中，并加入以下細(xì)胞因子：IL-2（10 IU/mL）、IL-3（100 IU/mL）、IL-4（100 IU/mL），IL-3（100 IU/mL），IL-4（100 IU/mL），和可溶性的IL-15（100 ng/mL）。（3）200μL體系,37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。（4）洗滌細(xì)胞兩次，1×105每孔重懸于含IL-2（10 IU/mL）的培養(yǎng)基中。（5）每隔3-4天更換新鮮的含IL-2的培養(yǎng)基。
說明：本內(nèi)容由發(fā)布者創(chuàng)建和發(fā)布，如涉侵權(quán)，請聯(lián)系發(fā)布者處理。本內(nèi)容僅代表發(fā)布者觀點(diǎn)，不代表平臺立場。
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com