腫瘤學(xué)必做實(shí)驗(yàn)詳解-3D培養(yǎng)血管生成

血管生成（Angiogenesis）是正常組織生長(zhǎng)及損傷修復(fù)的必要過(guò)程，在腫瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到重要作用。腫瘤組織具有高度血管化的特征，腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴(lài)新生血管的形成，新生血管成為腫瘤治療的潛在靶標(biāo)，若能阻斷腫瘤內(nèi)新生血管的形成則可抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

體外的血管生成實(shí)驗(yàn)?zāi)芎芎玫啬�擬腫瘤的血管發(fā)生過(guò)程，并且適合研究藥物對(duì)這一過(guò)程的影響實(shí)驗(yàn)。血管生成是一個(gè)高度調(diào)節(jié)的過(guò)程，在正常生理和許多病理過(guò)程中都起著重要作用，包括傷口愈合、腫瘤生長(zhǎng)以及炎癥轉(zhuǎn)移等。

傳統(tǒng)的血管生成實(shí)驗(yàn)高度依賴(lài)于天然細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），其具有不可調(diào)節(jié)的成分和性質(zhì)。VitroGel水凝膠無(wú)異源、成分限定，可以滿(mǎn)足內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等血生成研究， 以下詳細(xì)介紹HUVEC細(xì)胞在VitroGel水凝膠上形成管狀的過(guò)程。

【血管形成實(shí)驗(yàn)材料】
● VitroGel® Angiogenesis Assay Kit 
● HUVEC細(xì)胞 
● 細(xì)胞培養(yǎng)基 
● 生長(zhǎng)因子/抑制劑（可選） 
● 離心管（15 mL或 50 mL）
● 微量移液管 
● 離心機(jī) 
● 細(xì)胞培養(yǎng)板

即用型VitroGel 血管生成分析試劑盒（貨號(hào)：VHM06-K）組成： 
（1）VitroGel AAK，無(wú)動(dòng)物源成分的水凝膠。
（2）AAK Supplement 1，不含血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的水凝膠系統(tǒng)添加物，用于細(xì)胞的黏附與生長(zhǎng)。
（3）AAK Supplement 2，含VEGF的水凝膠系統(tǒng)添加物，用于血管生成的陽(yáng)性對(duì)照。
【血管生成-3D細(xì)胞培養(yǎng)操作步驟】

● 1. 將VitroGel AKK置于室溫或 37°C條件下回溫。
● 2. 用AAK Supplement 1制備細(xì)胞懸液。推薦細(xì)胞濃度為1-2 x 106 cells/mL。可選：為控制水凝膠中重要的生長(zhǎng)因子/抑制劑的組成，可在AAK Supplement 1中添加所需的生長(zhǎng)因子/抑制劑，濃度為3X。然后將調(diào)整的AAK Supplement混合物與VitroGel AAK水凝膠溶液混合，得到1X濃度生長(zhǎng)因子抑制劑的終溶液。
● 3. 吸取1 mL VitroGel AAK 水凝膠溶液與步驟2中 500 µL 細(xì)胞懸液緩慢混合，上下顛倒5-10次至均勻。（確保 VitroGel 水凝膠和細(xì)胞懸液以2:1 v/v 比例混合）。
● 4. 轉(zhuǎn)移水凝膠混合物至孔板中。輕輕傾斜/旋轉(zhuǎn)孔板，以確保每個(gè)孔的底部都能均勻地鋪滿(mǎn)。不同類(lèi)型孔板推薦的水凝膠混合物的體積如下表所示。

● 5. 室溫下靜置10-15 min，等待軟凝膠的形成。注：軟凝膠形成過(guò)程中，請(qǐng)勿傾斜或搖晃平板。
 ● 6. 小心地在水凝膠上部添加覆蓋培養(yǎng)基。不同類(lèi)型孔板推薦的覆蓋培養(yǎng)基體積如下表所示。

●  7. 置于培養(yǎng)箱中孵育 ，每48h可更換覆蓋表面的培養(yǎng)基。注：我們推薦的培養(yǎng)基換液量為50-80%，以免影響培養(yǎng)板中的水凝膠狀態(tài)。