Trziol法提取RNA所需試劑耗材及實(shí)驗(yàn)操作流程

隨著分子生物技術(shù)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等方面的廣泛應(yīng)用，RNA提取已成為研究基因表達(dá)、克隆目的基因等的一項(xiàng)基本試驗(yàn)技術(shù)。高質(zhì)量RNA的提取，是后續(xù)RT-PCR、qPCR、Northern blot、cDNA文庫構(gòu)建等正常進(jìn)行的必要前提。Trizol法是一種常見的提取總RNA的方法，在RNA得率及試劑成本方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。
 

圖1 Trizol法提取RNA流程

Trizol是一種較為流行的總RNA抽提試劑，可以直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA。其含有苯酚、異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞并抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶，因此對(duì)于純化RNA及標(biāo)準(zhǔn)化RNA的生產(chǎn)來說使用價(jià)值極高。

圖2
 

氯仿是分子量比較大的有機(jī)溶劑，在提取RNA時(shí)，氯仿可以有效的使有機(jī)相和無機(jī)相迅速分離。加入氯仿，離心后，樣品即分成水樣層（RNA存在于水樣層）、中間層（DNA和蛋白質(zhì)存在于中間層）和有機(jī)層。
細(xì)化它的主要作用點(diǎn)：
（1）作為有機(jī)溶劑變性蛋白，使其沉淀并通過離心除去，同時(shí)也通過變性作用抑制RNase活性；
（2）RNA提取試劑中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚），苯酚微溶于水，抽提烷之后水相里有痕量的酚，如果不除去會(huì)損傷核酸，需要通過氯仿把水相里參與的苯酚抽提掉；
（3）作為溶劑抽提樣品中的一些脂溶性雜質(zhì)（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除雜作用。
 

異丙醇的作用主要是沉淀RNA。RNA存在于水樣層中，收集水樣層后可以通過異丙醇沉淀RNA來還原。離心前沉淀不可見，離心棄上清后，可見膠狀的RNA沉淀。
 

75%乙醇主要由乙醇和DEPC水配置，主要用來洗滌粘附在RNA沉淀上的氯仿跟異丙醇。
 

DEPC處理水是經(jīng)DEPC（即diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙）處理過并經(jīng)高溫高壓滅菌的超純水（一級(jí)水），是一種無色液體。經(jīng)檢測(cè)不含雜質(zhì)RNA、DNA、核酸酶和蛋白質(zhì)。本產(chǎn)品可以用于RNA沉淀的溶解，含有RNA的各種反應(yīng)體系，以及其它要求無RNase、DNase和proteinase的反應(yīng)體系。
 

實(shí)驗(yàn)操作流程

一、細(xì)胞裂解

1、組織樣本：

Trizol用量：每50-100mg 組織加1 ml Trizol，樣品體積不應(yīng)超過Trizol體積的10％。
（1）將動(dòng)物或植物組織切成小塊，在液氮中磨碎或用勻漿器勻漿處理；
（2）將研磨好的組織粉末快速轉(zhuǎn)入裝有1ml Trizol的2 ml離心管中，在渦旋振蕩器上迅速振蕩混勻，置于冰上，待所有的樣品研磨完；
（3）裂解產(chǎn)物應(yīng)呈澄清的透明粘稠液體。對(duì)于富含蛋白、脂肪或多糖物質(zhì)的組織樣品如肌肉、脂肪組織和植物結(jié)節(jié)部位等，勻漿后仍會(huì)存留有不溶物質(zhì)，可于4℃ 12,000 x g 離心10min，然后吸取上清至一新的離心管中。
 

2、細(xì)胞樣本：
（1）貼壁細(xì)胞：吸盡培養(yǎng)液，每10cm2培養(yǎng)面積（6孔板單孔或35 mm平皿）加入1ml Trizol，用加樣器吹打數(shù)次，以確保細(xì)胞完全裂解，然后轉(zhuǎn)移至離心管中。注：Trizol的使用量應(yīng)由培養(yǎng)皿表面積決定，而非由細(xì)胞數(shù)目決定。Trizol量不足可能導(dǎo)致提取的RNA中有DNA污染；
（2）懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，吸盡液體，每 5-10×106動(dòng)植物或酵母細(xì)胞，或每 1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml Trizol，用加樣器吹打，使其完全裂解，然后轉(zhuǎn)移至離心管中。

注：添加Trizol前切勿洗滌細(xì)胞 ，以免RNA降解。必要時(shí)可以用勻漿器來裂解某些細(xì)菌或者酵母細(xì)胞。
 

（1）裂解產(chǎn)物于室溫放置5min，使核酸-蛋白復(fù)合物完全分離；（注：此時(shí)樣品可在-80℃長期保存。）
（2）每1ml Trizol加入0.2ml氯仿，蓋緊管蓋，劇烈振蕩15s，室溫放置2-3min；
（3）4℃ 12,000 x g離心15min，樣品會(huì)分成三層：桔黃色的下層有機(jī)相，中間層和無色的上層水相；
（4）吸取含總RNA的上層水相至一新的離心管中，吸取水相的體積為所用Trizol試劑的60％。
 

（1）按照每1ml Trizol的最初使用量加入0.5ml異丙醇，顛倒數(shù)次混勻，室溫放置10min；
（2）4℃ 12,000 x g 離心10min，棄除上清，可見膠狀的RNA沉淀；
（3）按照每1ml Trizol的最初使用量加入1ml 75%乙醇，顛倒數(shù)次混勻，洗滌沉淀；
（4）4℃ 12,000 x g離心5min，棄除上清；
（5）室溫倒置5-10min晾干或真空抽干（不要使用真空干燥離心機(jī)，以免RNA過干，難以溶解）；
（6）加入適量（如25ul）DEPC-ddH2O或TE緩沖液，用加樣器吹打數(shù)次溶解RNA；
（7）通過RNA電泳以及紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，確定RNA的濃度、純度和完整性；
（8）所得的RNA應(yīng)立即使用或適量分裝后-80℃保存，避免反復(fù)凍融。