原位PCR使用原理、分類(lèi)及應(yīng)用介紹
原位PCR
1概述
自20世紀(jì)80年代中期PCR技術(shù)誕生以來(lái), 研究人員就一直探索著將PCR技術(shù)與形態(tài)學(xué)研究結(jié)合起來(lái)。1990年, A.T. Haase等首創(chuàng)了原位PCR(In situ PCR, ISPCR), 當(dāng)時(shí)稱為 “細(xì)胞內(nèi)PCR”。原位PCR是原位雜交和PCR結(jié)合的產(chǎn)物, 兼有二者的優(yōu)點(diǎn), 具有較好的靈敏性與專一性, 可同時(shí)獲得組織、細(xì)胞及染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)信息與分子信息, 又能檢測(cè)出細(xì)胞中單拷貝或低拷貝的DNA、RNA序列。
2 原位PCR原理
原位PCR是通過(guò)在單細(xì)胞或組織切片上對(duì)特異DNA(或cDNA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 然后采用原位雜交或免疫組織化學(xué)反應(yīng)、熒光檢測(cè)等技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列的檢出及定位的分子技術(shù)。原位PCR技術(shù)的待檢標(biāo)本一般先經(jīng)化學(xué)固定，以保持組織細(xì)胞的良好形態(tài)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜和核膜均具有一定的通透性，當(dāng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，各種成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)，以固定在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)的RNA或DNA為模板，于原位進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的產(chǎn)物一般分子較大，或互相交織，不易穿過(guò)細(xì)胞膜或在膜內(nèi)外彌散，從而被保留在原位。這樣原有的細(xì)胞內(nèi)單拷貝或低拷貝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指數(shù)極擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物就很容易被原位雜交技術(shù)檢查。
3 原位PCR類(lèi)型
3.1 直接原位PCR
直接原位PCR是使用標(biāo)記的引物或游離核苷酸進(jìn)行原位PCR反應(yīng), 這種標(biāo)記分子隨后進(jìn)入擴(kuò)增產(chǎn)物中, 擴(kuò)增結(jié)果可直接觀察而不需要進(jìn)行原位雜交(圖1) 。
優(yōu)點(diǎn)：
（1）操作簡(jiǎn)便；
（2）流程短；
（3）省時(shí)。
自20世紀(jì)80年代中期PCR技術(shù)誕生以來(lái), 研究人員就一直探索著將PCR技術(shù)與形態(tài)學(xué)研究結(jié)合起來(lái)。1990年, A.T. Haase等首創(chuàng)了原位PCR(In situ PCR, ISPCR), 當(dāng)時(shí)稱為 “細(xì)胞內(nèi)PCR”。原位PCR是原位雜交和PCR結(jié)合的產(chǎn)物, 兼有二者的優(yōu)點(diǎn), 具有較好的靈敏性與專一性, 可同時(shí)獲得組織、細(xì)胞及染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)信息與分子信息, 又能檢測(cè)出細(xì)胞中單拷貝或低拷貝的DNA、RNA序列。
2 原位PCR原理
原位PCR是通過(guò)在單細(xì)胞或組織切片上對(duì)特異DNA(或cDNA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 然后采用原位雜交或免疫組織化學(xué)反應(yīng)、熒光檢測(cè)等技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列的檢出及定位的分子技術(shù)。原位PCR技術(shù)的待檢標(biāo)本一般先經(jīng)化學(xué)固定，以保持組織細(xì)胞的良好形態(tài)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜和核膜均具有一定的通透性，當(dāng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，各種成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)，以固定在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)的RNA或DNA為模板，于原位進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的產(chǎn)物一般分子較大，或互相交織，不易穿過(guò)細(xì)胞膜或在膜內(nèi)外彌散，從而被保留在原位。這樣原有的細(xì)胞內(nèi)單拷貝或低拷貝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指數(shù)極擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物就很容易被原位雜交技術(shù)檢查。
3 原位PCR類(lèi)型
3.1 直接原位PCR
直接原位PCR是使用標(biāo)記的引物或游離核苷酸進(jìn)行原位PCR反應(yīng), 這種標(biāo)記分子隨后進(jìn)入擴(kuò)增產(chǎn)物中, 擴(kuò)增結(jié)果可直接觀察而不需要進(jìn)行原位雜交(圖1) 。
優(yōu)點(diǎn)：
（1）操作簡(jiǎn)便；
（2）流程短；
（3）省時(shí)。
缺點(diǎn)：
（1）易發(fā)生引物錯(cuò)配或非特異性退火, 容易出現(xiàn)假陽(yáng)性;
（2）標(biāo)記的引物會(huì)降低PCR效率。
3.2 間接原位PCR
間接原位PCR是在沒(méi)有標(biāo)記物的情況下進(jìn)行PCR反應(yīng), 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后, 再用原位雜交技術(shù)來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增的信號(hào)(圖1)。
優(yōu)點(diǎn)：可以克服由于DNA修復(fù)或引物錯(cuò)配引起的非特異性問(wèn)題, 成為目前最廣泛使用的方案。
缺點(diǎn)：需要進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)后的洗脫和原位雜交過(guò)程, 所需時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。
（1）易發(fā)生引物錯(cuò)配或非特異性退火, 容易出現(xiàn)假陽(yáng)性;
（2）標(biāo)記的引物會(huì)降低PCR效率。
3.2 間接原位PCR
間接原位PCR是在沒(méi)有標(biāo)記物的情況下進(jìn)行PCR反應(yīng), 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后, 再用原位雜交技術(shù)來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增的信號(hào)(圖1)。
優(yōu)點(diǎn)：可以克服由于DNA修復(fù)或引物錯(cuò)配引起的非特異性問(wèn)題, 成為目前最廣泛使用的方案。
缺點(diǎn)：需要進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)后的洗脫和原位雜交過(guò)程, 所需時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。
圖1 直接原位PCR和間接原位PCR
3.3 原位反轉(zhuǎn)錄PCR
在原位 PCR 中加上一步反轉(zhuǎn)錄過(guò)程(RT) , 新形成的cDNA作為模板用于擴(kuò)增, 這個(gè)過(guò)程叫做原位反轉(zhuǎn)錄PCR( in situ reverse transcription PCR, 簡(jiǎn)稱原位RTPCR)。它又分為直接原位RTPCR和間接原位RTPCR兩種(圖2)。
原位RT PCR可用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞或組織中低拷貝的mRNA或特異基因的表達(dá)。
Tips：在原位 RTPCR 中, 首先要對(duì)組織樣品進(jìn)DNA 酶處理, 以破壞組織細(xì)胞中的DNA。
圖2 原位反轉(zhuǎn)錄PCR
3.4 PCR原位再生式序列復(fù)制反應(yīng)
Zebe等1994年率先提出了原位再生式復(fù)制反應(yīng)( Selfsustained sequence replication reaction, 簡(jiǎn)稱3SR反應(yīng))。它可作為原位RTPCR的一種選擇方法用于完整的細(xì)胞和組織切片中低拷貝數(shù)mRNA的檢測(cè)。
優(yōu)點(diǎn)：有利于與免疫組織化學(xué)相結(jié)合。
4 植物原位 PCR 技術(shù)的操作步驟
植物原位 PCR 的基本步驟包括標(biāo)本制備、預(yù)處理、原位擴(kuò)增、后處理和檢測(cè)等。
4.1 標(biāo)本制備
固定劑的選擇和固定的時(shí)間、溫度因材料標(biāo)本不同而各異。但固定條件的確定, 必須同時(shí)滿足 2 個(gè)條件:
①保持染色體、細(xì)胞和組織標(biāo)本形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性;
②將原位程序中擴(kuò)增效率的損失減到最小。
Tips：
①對(duì)于DNA的原位 PCR, 交聯(lián)型固定劑(福爾馬林、4%多聚甲醛、中性甲醛)較為適宜。交聯(lián)型固定劑較利于蛋白質(zhì)和核酸互相交聯(lián), 使擴(kuò)增產(chǎn)物保留在原位,防止其向細(xì)胞外擴(kuò)散或被洗脫。
②固定時(shí)的溫度也會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響, 室溫或 37℃固定24～48 h, 可獲最強(qiáng)信號(hào)。
③標(biāo)本的年齡對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響也很大, 最好采用新鮮制備的不超過(guò)1個(gè)月的染色體標(biāo)本。用新鮮固定的細(xì)胞做原位 PCR, 要比存檔的石蠟切片做原位 PCR 敏感得多。
4.2 預(yù)處理
預(yù)處理可增加細(xì)胞的通透性, 促使反應(yīng)試劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi), 并使待擴(kuò)增的靶序列暴露。在進(jìn)行消化處理時(shí), 酶種類(lèi)的選擇、濃度、溫度和處理時(shí)間等條件的優(yōu)化對(duì)于原位PCR都很重要
Tips：
①胃蛋白酶、胰蛋白酶或蛋白酶K均可用于消化。推薦使用胃蛋白酶或胰蛋白酶, 因?yàn)榈鞍酌窴較難失活且易引起過(guò)度消化, 而胃蛋白酶、胰蛋白酶在以后的洗滌步驟中, 可通過(guò)提高pH抑制其活性, 或通過(guò)加熱使其失活。
②酶處理的方法取決于固定劑和標(biāo)本類(lèi)型。多聚甲醛和戊-二-醛固定的材料比FAA固定的材料需更長(zhǎng)的酶處理時(shí)間, 且具小液泡的組織比具大液泡的組織預(yù)處理時(shí)間更長(zhǎng)。
③組織切片的細(xì)胞仍具有細(xì)胞壁, 應(yīng)進(jìn)行適宜的預(yù)處理。
④對(duì)于解離好的染色體標(biāo)本可不必進(jìn)行蛋白酶消化, 而對(duì)于解離不充分的染色體標(biāo)本要特別注意消化過(guò)度或消化不足。消化過(guò)度則擴(kuò)增的靶序列易丟失, 消化不足則不利反應(yīng)液的進(jìn)入, 二者均會(huì)導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)。
⑤有時(shí)候, 蛋白酶消化之前還需進(jìn)行一些其他處理, 如進(jìn)行蛋白酶消化之前, 進(jìn)行了果膠酶處理。果膠酶處理可去除非特異性物質(zhì)的污染。
4.3 原位擴(kuò)增
原位PCR擴(kuò)增體系中, 各組分的濃度和反應(yīng)溫度、時(shí)間、循環(huán)次數(shù)等的優(yōu)化極為重要。由于玻片和細(xì)胞蛋白可能對(duì)反應(yīng)液有所吸附, 因此, 與液相PCR相比, 原位PCR擴(kuò)增溶液中各組分濃度相對(duì)較高。
Tips：
①液相PCR中最優(yōu)的MgCl2濃度為1.5 mmol/L, 而原位PCR中為4.5 mmol/L;
②液相PCR中Taq DNA聚合酶的常規(guī)使用量為1.5 U, 而原位PCR要5 U才能產(chǎn)生較強(qiáng)的信號(hào)；
③反應(yīng)溫度因引物而定；
④循環(huán)次數(shù)不宜過(guò)高, 一般為20～30。
⑤為了提高特異性, 可采用多步循環(huán)法或半套式擴(kuò)增。
⑥為了確定原位 PCR 檢測(cè)的準(zhǔn)確性, 必須設(shè)置陰性對(duì)照, 可設(shè)置為擴(kuò)增反應(yīng)液中不加入 Taq DNA聚合酶或引物。
⑦間接法原位PCR反應(yīng)液中的組分與普通PCR一樣, 而直接原位PCR反應(yīng)液中則包含了標(biāo)記的引物或單核苷酸。在目前植物原位PCR的成功報(bào)道中, 都采用DIG-11-dUTP單核苷酸標(biāo)記, 但dTTP與DIG-11-dUTP的使用濃度、二者的比例
各不相同。dTTP 和DIG-11-dUTP的終濃度比是原位擴(kuò)增順利進(jìn)行的一個(gè)要素, 比值太高會(huì)使得DIG-11-dUTP在擴(kuò)增過(guò)程中失去競(jìng)爭(zhēng)力, 比值太低可能使信號(hào)擴(kuò)散, DIG-11-dUTP 的濃度太高會(huì)形成空間阻礙。因此, 要優(yōu)化出最適宜的濃度和比例。
⑧反應(yīng)液的體積應(yīng)根據(jù)標(biāo)本在玻片上的多少進(jìn)行調(diào)整, 挑選合適大小的原位克隆環(huán)EasiSeal, 以防止反應(yīng)液溢出或覆蓋不足。
⑨應(yīng)根據(jù)不同植物材料、不同標(biāo)本類(lèi)型等各種因素, 優(yōu)化出適宜的原位PCR體系,才能獲得理想的結(jié)果。
4.4 后處理
大部分標(biāo)本在原位擴(kuò)增后要進(jìn)行洗滌, 以降低背景和保留強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)。針對(duì)不同的標(biāo)本及其檢測(cè)方法, 其后處理也有所不同。
Tips：
①為提高檢測(cè)靈敏性和特異性, 使擴(kuò)增產(chǎn)物保留在細(xì)胞內(nèi), 在洗滌完后, 用4%多聚甲醛或2%戊-二-醛對(duì)材料進(jìn)行后固定, 可獲得較好的效果。
②對(duì)于染色體標(biāo)本, 特別是纖維素酶和果膠酶處理較好的染色體標(biāo)本, 其不似組織或細(xì)胞標(biāo)本有細(xì)胞壁的保護(hù), 擴(kuò)增后的洗滌必須降低強(qiáng)度, 否則很容易使擴(kuò)增信號(hào)丟失。
③洗滌強(qiáng)度應(yīng)根據(jù)檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行優(yōu)化, 若信號(hào)擴(kuò)散可增加洗滌強(qiáng)度, 若出現(xiàn)假陰性, 則要降低洗滌強(qiáng)度。
4.5 檢測(cè)
目前, 使用非放射性標(biāo)記和檢測(cè)DNA探針有生物素標(biāo)記、地-高-辛標(biāo)記和熒光素標(biāo)記3 大檢測(cè)系統(tǒng)。
Tips：
①采用地-高-辛標(biāo)記檢測(cè)系統(tǒng), 用 NBT/BCIP(硝基四唑藍(lán)/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽)顯色進(jìn)行檢測(cè)。
②采用 Anti-DIG-Fluorescein(熒光綠－地-高-辛抗體)進(jìn)行免疫反應(yīng), 在顯色反應(yīng)中可選擇DAPI (4,6-二脒基-2-苯基吲哚)或PI (碘化丙啶), 或DAPI/PI, 選擇合適的熒光激發(fā)塊進(jìn)行檢測(cè)。
③原位PCR的檢測(cè)系統(tǒng)可參考原位雜交的檢測(cè)方法進(jìn)行。
5 原位PCR的應(yīng)用
5.1 在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用
（1）疾病中外源性基因檢測(cè)；
（2）診斷和某些相應(yīng)基因的定位, 如HIV、HBV、EB 等病毒的檢測(cè)。
5.2 在動(dòng)物上的應(yīng)用
主要用于流行病毒的檢測(cè)。
5.3 在植物上的應(yīng)用
（1）細(xì)胞或組織水平上的基因檢測(cè)和定位；
（2）染色體水平上的基因檢測(cè)和定位；
（3）單拷貝、低拷貝和多拷貝基因或特異序列的檢測(cè)；
①檢測(cè)植物材料是否受到外源致病基因的侵染和侵染部位;
②檢測(cè)內(nèi)源基因或特異序列在植物細(xì)胞或組織中的表達(dá)及分布;
③確定內(nèi)源基因、特異序列及各種抗性基因在染色體上的位置；
④結(jié)合染色體帶型分析, 構(gòu)建物理圖譜。
（4）雜種中親本染色體的鑒定；
（5）物種進(jìn)化的研究；
（6）遺傳轉(zhuǎn)化材料的分析。
雖然目前原位 PCR 技術(shù)在植物上的應(yīng)用存在一定的困難, 但隨著技術(shù)的成熟, 其應(yīng)用前景必將廣闊。只要在某種作物上建立了原位PCR體系, 則可為該類(lèi)作物功能基因的研究奠定基礎(chǔ)，在該類(lèi)作物上的相關(guān)研究將會(huì)有更大的發(fā)展空間。
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