螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶報告基因來源和實驗應(yīng)用

報告基因（Reporter Gene）技術(shù)是常用于檢測轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄活性，或啟動子、增強子等及其中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件活性、或者5’或3’-UTR等及其中的調(diào)控元件活性的重要技術(shù)。報告基因既可以用于檢測反式作用因子(trans-element)如轉(zhuǎn)錄因子等的活性，也可以用于檢測順式作用因子(cis-element)如DNA中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、mRNA的3’-UTR中miRNA結(jié)合位點等的調(diào)控活性。

二，理想的報告基因須具備什么條件呢？

1.表達產(chǎn)物必須與細胞內(nèi)源基因相區(qū)別，編碼產(chǎn)物的活性不受宿主細胞的干預(yù)。

2.報告基因編碼產(chǎn)物的檢測快速簡便、經(jīng)濟、靈敏高，且重現(xiàn)性好、結(jié)果可靠，測量數(shù)據(jù)應(yīng)該有較寬的線性范圍。

3.細胞內(nèi)的其它基因產(chǎn)物不會干擾報告基因產(chǎn)物的檢測，同時報告基因的表達也不改變宿主細胞的生理功能。

常用的報告基因有：氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 （CAT），β半乳糖苷酶（β-gal或LacZ），螢光素酶（Luciferase）以及EGFP等熒光蛋白。其中螢光素酶報告基因具有檢測便捷、靈敏度高、線性范圍寬、可以進行活細胞和活體檢測等優(yōu)點，使用非常廣泛。

三，什么是螢光素酶？

螢光素酶是自然界中能夠產(chǎn)生生物螢光的酶的統(tǒng)稱。螢光素酶可以催化螢光素氧化成氧化螢光素，在螢光素氧化的過程中，會發(fā)出生物螢光。然后可以通過螢光測定儀(化學(xué)發(fā)光儀)測定過程中釋放的生物螢光(化學(xué)發(fā)光)。目前，最有代表性的是從螢火蟲中分離得到的螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）和從海腎中分離得到的海腎熒光素酶（Renilla luciferase），還有近年來研究較多的來源于夏威夷水域的一種大型海洋橈腳類(Copepod)動物獲得的Gaussia Luciferase。

螢火蟲螢光素酶（Firefly luciferase）是一種分子量約為61kD的蛋白，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中，會發(fā)出波長為560nm左右的生物螢光(bioluminescence)，是目前體內(nèi)外檢測實驗中最常用的螢光素酶。在此基礎(chǔ)上還有用于高靈敏度檢測的快速降解型螢火蟲熒光素酶，例如pGL6-TA-CP(超靈敏快速降解型報告基因質(zhì)粒) (D2094)。
 

海腎螢光素酶（Renilla luciferase）是一種分子量約為36kD的蛋白，在氧氣存在的條件下，可以催化腔腸素(Coelenterazine)氧化成Coelenteramide，反應(yīng)過程無需ATP和鎂離子參與。在Coelenterazine氧化的過程中，會發(fā)出波長為480nm左右的生物螢光(bioluminescence)。

圖1. 螢光素酶的反應(yīng)原理圖

四，實驗應(yīng)用

轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達功能的蛋白質(zhì)分子，轉(zhuǎn)錄因子與其靶啟動子中的特異性識別序列結(jié)合，從而對基因的表達起抑制或增強的作用。借助螢光素和螢光素酶這一生物發(fā)光體系，可以極其靈敏、高效地檢測熒光素酶的表達水平。從而可以用于檢測轉(zhuǎn)錄因子的活性，基因啟動子、增強子等及其調(diào)控元件的活性或者mRNA中5’或3’-UTR中的相關(guān)調(diào)控元件活性。
 

其具體的研究思路簡述如下：

（1）構(gòu)建一個將特定啟動子或增強子，或特定待研究的調(diào)控元件插入到螢光素酶表達序列前方的報告基因質(zhì)粒。進一步借助相應(yīng)調(diào)控元件的突變研究，此時可以用于研究基因啟動子、增強子等及其調(diào)控元件的活性了。
 

（2）構(gòu)建一個包含多個已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的報告基因質(zhì)粒，例如pNFκB-TA-luc (D2207)，這樣就可以用于研究細胞中NFκB這個轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活水平了。
 

（3）構(gòu)建一個包含mRNA 3’-UTR的報告基因質(zhì)粒，推薦使用pGL6-miR (D2106)，把3’-UTR放在luciferase的后邊，轉(zhuǎn)錄后luciferase mRNA的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性就會受該3’-UTR的調(diào)控。通過3’-UTR的點突變等，就可以研究3’-UTR的調(diào)控作用以及miRNA對于該3’-UTR的調(diào)控了。
 

（4） 通常將上述的報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞。如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶序列，則螢光素酶基因就會表達，螢光素酶的表達量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強度成正比。3’-UTR等可以調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性和翻譯活性，最終的調(diào)控活性也和熒光素酶的活性正相關(guān)。
 

（5）加入特定的螢光素酶檢測試劑，螢光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生螢光，通過檢測螢光的強度可以測定螢光素酶的活性。

圖2. 螢光素酶報告實驗圖解

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