利用Scn5a 的體內(nèi)堿基編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)長(zhǎng)QT綜合征小鼠模型的基因治療

圖1.通過(guò)堿基編輯器對(duì)出生后小鼠心臟中的 Scn5a 基因組進(jìn)行編輯


 

圖2.攜帶Scn5a T1307M致病性變異的LQT3小鼠模型的生成
 

同時(shí)還對(duì)小鼠模型離體心臟進(jìn)行了光學(xué)標(biāo)測(cè)，結(jié)果顯示，與 WT 小鼠相比，心室傳導(dǎo)無(wú)差異，但雜合子和純合子 T1307M 小鼠的心室動(dòng)作電位時(shí)程 APD90顯著延長(zhǎng)，APD30 / APD80比率增加（圖 S8）。當(dāng)從心尖給予 8 Hz 刺激時(shí)，獲得了一致的結(jié)果。然后，我們通過(guò)全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)了離體心室心肌細(xì)胞的動(dòng)作電位和鈉電流。與 WT 肌細(xì)胞相比，Scn5a T1307M心肌細(xì)胞的晚期鈉電流密度顯著增加，都體現(xiàn)了人類(lèi)LQT3的疾病表型。以上結(jié)果說(shuō)明模型構(gòu)建成功。
 

圖S8. 自發(fā)節(jié)律下離體心臟的光學(xué)標(biāo)測(cè)
 

2. ABE 對(duì) Scn5a T1307M 的體內(nèi)校正并減輕了LQT3表型
T1307M突變是由堿基C變成T形成的。ABE堿基編輯器能將T轉(zhuǎn)變成C，進(jìn)而糾正堿基突變。實(shí)驗(yàn)中采用反式剪接將ABE分成兩段后，利用AAV9送到小鼠體內(nèi)。單次腹腔注射AAV9-ABE 病毒可以實(shí)現(xiàn)~40%的DNA糾正及~70%的mRNA糾正。而AAV9主要是感染心肌細(xì)胞，Scn5a主要在心肌細(xì)胞中表達(dá)，所以在Scn5a mRNA水平的糾正效率高。這些發(fā)現(xiàn)表明 ABE 可以有效糾正小鼠心臟中的 Scn5a T1307M 序列變異。ABE治療還減少了雜合子和純合小鼠中由卡巴膽堿給藥引起的心竇驟停，并消除了純合子 Scn5a T1307M 小鼠中卡巴膽堿誘導(dǎo)的 TdP 或 VT（圖3）。以上結(jié)果說(shuō)明堿基編輯技術(shù)針對(duì)心肌細(xì)胞的基因編輯治療對(duì)于電生理功能表型是有效和安全的，可以有效的減輕 LQT3 表型。
 

圖3. 體內(nèi)堿基編輯技術(shù)減輕了 LQT3 表型。
 

3.T1307M小鼠堿基編輯的治療閾值及脫靶效應(yīng)檢測(cè)
為了探究多高的編輯效率可以治療 LQT3 表型，研究人員向新生2周齡的雜合小鼠腹腔注射AAV9-ABE病毒。10周后，觀察到 T1307M mRNA的修正率從 23.29% 到 95.72% 不等。將mRNA修正率與 QT間期以及竇性停搏次數(shù)關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示隨著修正率的增加，QT及QTc間期逐漸縮短，卡巴膽堿誘導(dǎo)的竇性停搏次數(shù)逐漸下降（圖4），即使較低的編輯效率，也能減輕長(zhǎng)QT的表型。

當(dāng)mRNA 的修正率超過(guò)60%時(shí)，可完全消除雜合小鼠的心律失常表型。同時(shí)，在純合T1307M小鼠中，堿基編輯還消除了致命性室性心動(dòng)過(guò)速（圖4）。這些結(jié)果表明編輯效率達(dá)到一定的閾值時(shí)，可以完全消除心律失常表型。
 

圖4.T1307M小鼠堿基編輯的治療閾值
 

為了評(píng)價(jià)ABE心臟治療的安全性，研究人員對(duì)基因編輯后的心臟DNA進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)明顯的DNA或RNA脫靶（圖5）。堿基編輯也沒(méi)有引發(fā)額外的心率失常。這些結(jié)果表明 ABE 是一種安全的體內(nèi)心臟編輯工具。
 

圖5.堿基編輯器的脫靶效應(yīng)檢測(cè)


圖6.總體示意圖模型

總之，這些研究表明，體內(nèi) AAV9-ABEmax 編輯可以糾正變異的 Scn5a 等位基因，有效改善心律失常表型。為遺傳性心律失常的治療提供了有效的概念性證明。