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實(shí)驗(yàn)室PCR儀的工作原理、標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)和用途

瀏覽次數(shù):1052 發(fā)布日期:2024-4-8  來(lái)源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
一、PCR儀定義:

通過(guò)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù),對(duì)特定DNA進(jìn)行擴(kuò)增的儀器。

普通PCR儀:只進(jìn)行PCR擴(kuò)增的PCR儀,實(shí)際上是一個(gè)溫控設(shè)備。普通PCR儀只能實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增,分析檢測(cè)需要在擴(kuò)增之后。而擴(kuò)增后到檢測(cè)分析的這個(gè)過(guò)程,因?yàn)橐獙悠分袃x器中取出來(lái),所以容易受到污染,同時(shí)也容易污染環(huán)境。
 
PCR儀
 
實(shí)時(shí)熒光PCR儀:在普通PCR儀的基礎(chǔ)上增加熒光信號(hào)采集系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)。在作為溫控設(shè)備的同時(shí)加入熒光分析系統(tǒng)。

在擴(kuò)增的同時(shí),通過(guò)前期準(zhǔn)備工作的時(shí)候,PCR擴(kuò)增體系中加入熒光集團(tuán),而后通過(guò)熒光信號(hào)采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)采集,存儲(chǔ)數(shù)據(jù),將檢測(cè)分析步驟集中到儀器上,減少人員后續(xù)的檢測(cè)操作,降低了污染和被污染的風(fēng)險(xiǎn)。

二、PCR儀工作原理:

下面的步驟是PCR的反應(yīng)原理,同時(shí)也是PCR儀的工作原理。

簡(jiǎn)單的說(shuō),就是通過(guò)高溫變性,退火復(fù)性,延伸復(fù)制三個(gè)部分。

雙鏈DNA在一定的環(huán)境中,通過(guò)在90-95℃變性,形成單鏈,然后退火降溫到40-60℃,
在引物及其他輔助因子的作用下,使其初步結(jié)合,再快速升溫至70-75℃,在相關(guān)酶的催化作用下,合成雙鏈。完成一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。

由此我們也可以得出PCR儀的一個(gè)主要參數(shù):溫度,溫度示值是否準(zhǔn)確,升溫速率的快慢是影響其的一個(gè)主要因素。

具體要加什么緩沖液,要加什么引物,以及其他一些輔助因子,后續(xù)我們?cè)偃チ私狻?br />
三、PCR儀的校準(zhǔn)參數(shù)

我們上面提到了反應(yīng)的原理,由此我們可以簡(jiǎn)單的推斷:溫度作為變性-復(fù)性-延伸的基本設(shè)置,這個(gè)是我們需要校準(zhǔn)的一個(gè)項(xiàng)目。

那么在反應(yīng)的過(guò)程中,溫度示值與設(shè)定值是否準(zhǔn)確,我們需要知道。這是第一個(gè)溫度示值誤差;因?yàn)槲覀冃枰郎,降溫,升溫,這是不是涉及到一個(gè)速率的問(wèn)題,升降溫的快慢,會(huì)直接影響到整個(gè)反應(yīng)過(guò)程,所以,升降溫速率也是我們需要考量的一個(gè)方向。儀器通過(guò)加熱模塊去控制溫度,在快速升降溫的過(guò)程中,儀器不可避免的會(huì)先升高/降低溫度之后,再達(dá)到所設(shè)定的問(wèn)題,這就是溫度的過(guò)沖,這也是可能也是一個(gè)考量的指標(biāo)。達(dá)到一定的溫度之后,儀器要平衡一段時(shí)間(所設(shè)定的時(shí)間),而溫度平衡的時(shí)間和設(shè)置的時(shí)間,是否一致,也是要考慮的一個(gè)方向。不同的DNA模板,需要的溫度和解鏈的時(shí)間不一樣,如果解鏈的時(shí)間沒(méi)達(dá)到要求,DNA沒(méi)有完全變性,在降溫復(fù)性的過(guò)程中,會(huì)恢復(fù)到天然的狀態(tài)。

PCR儀有48孔、96孔,384孔,每一個(gè)孔都可以放一個(gè)樣品,自然我們上面所說(shuō)的溫度參數(shù),還是有一些不全。這里大致總結(jié)一下:溫度示值誤差、溫度均勻性、溫度最大沖量、溫度持續(xù)時(shí)間準(zhǔn)確度、平均升降溫速率,最大升降溫速率等。

四、PCR儀用途:

簡(jiǎn)單的來(lái)說(shuō),就是所采集到的樣品含量太低,無(wú)法正常的用儀器進(jìn)行檢測(cè)分析,所以需要通過(guò)PCR儀PCR技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)樣品擴(kuò)增。擴(kuò)增的倍數(shù)2N次方。2-4-8-16-32-64-128-256······
通過(guò)這個(gè)技術(shù),可以用于分子生物學(xué)研究:核酸定量分析,基因表達(dá)差異分析等等。醫(yī)學(xué)研究:產(chǎn)前診斷,病原體檢測(cè)如最近的新冠病毒等等方面。
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