全能核酸酶多樣化應(yīng)用場(chǎng)景介紹

全能核酸酶，又稱(chēng)非限制性核酸內(nèi)切酶，是一種來(lái)源于Serratia Marcescen的非特異性核酸內(nèi)切酶，可以降解各種形式的（雙鏈，單鏈，線狀，環(huán)狀，天然或變性）DNA和RNA，產(chǎn)生3-5個(gè)堿基長(zhǎng)度的5'-單磷酸寡核苷酸。無(wú)論是實(shí)驗(yàn)研究，還是工業(yè)生產(chǎn)，全能核酸酶都是目前唯一能夠同時(shí)有效去除DNA和ＲNA的酶。
 

一，廣闊的應(yīng)用前景

1,降低細(xì)胞/細(xì)菌裂解時(shí)核酸釋放產(chǎn)生的黏度，并且適用于任何裂解方式。

2,在大規(guī)模的層析純化時(shí)，避免由于大量的核酸吸附在層析介質(zhì)上降低蛋白質(zhì)的有效載量從而降低純化得率。

3,在 ELISA、二維電泳和免疫印跡分析中，提高分辨率和回收率，這對(duì)于準(zhǔn)確、高效地分析生物樣品至關(guān)重要。

4,消除重組蛋白、疫苗等生物制品的外源性核酸殘留，這是確保產(chǎn)品安全、有效的關(guān)鍵步驟。

二，全能核酸酶的應(yīng)用

1,E.coli表達(dá)的重組蛋白純化

對(duì)于某些大腸桿菌表達(dá)的蛋白，很容易形成包涵體，在純化的過(guò)程中常常與宿主DNA纏繞在一起，破碎的菌體往往非常粘稠，大大降低了蛋白的純化效率。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳可以發(fā)現(xiàn)，宿主DNA確實(shí)會(huì)與蛋白結(jié)合，并在一定程度上限制了全能核酸酶的消化。通過(guò)延長(zhǎng)全能核酸酶的處理時(shí)間或增加用量，可以有效去除結(jié)合的宿主DNA。

 

圖1. 1-5：經(jīng)過(guò)全能核酸酶不同時(shí)長(zhǎng)處理的樣品，處理時(shí)間越長(zhǎng)，效果越好

2,Western-blot實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

W-B實(shí)驗(yàn)常常用于研究蛋白質(zhì)間的相互作用，當(dāng)我們?cè)谘芯考?xì)胞中蛋白互作網(wǎng)絡(luò)時(shí)，提取的蛋白樣本中往往含有大量核酸，使得研究者難以分辨這種互作關(guān)系是蛋白-蛋白之間形成的，還是由DNA的橋接間接導(dǎo)致的。同時(shí)，核酸的存在也會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果條帶不清晰、背景較雜。
 

用全能核酸酶預(yù)處理樣品，一方面可以避免這種DNA的橋接作用的影響，另一方面可以減少背景雜質(zhì)。

 

圖2. +：用全能核酸酶預(yù)處理樣品，—：未使用全能核酸酶處理的樣本

3,CHIP-seq實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

衰老的發(fā)生與大量染色質(zhì)變化同時(shí)發(fā)生，這很有可能就是衰老的原因。目前，研究這類(lèi)變化的首選方法是染色質(zhì)免疫沉淀，然后進(jìn)行測(cè)序 (ChIP-Seq)。早期常用的方法是甲醛處理細(xì)胞，再通過(guò)超聲處理產(chǎn)生150到300 bp之間的染色質(zhì)片段來(lái)完成的。但是通過(guò)這種方式得到的DNA量太少，不足以用于測(cè)序。使用全能核酸酶消化DNA和RNA，可以輕松地從衰老細(xì)胞中分離染色質(zhì)。全能核酸酶不具有蛋白酶活性，可以輕易獲得足夠的DNA并進(jìn)行測(cè)序。

 

圖3. 20 分鐘內(nèi)RKO細(xì)胞中全能核酸酶對(duì)染色質(zhì)消化的比較

4,PBMC細(xì)胞結(jié)團(tuán)

近年來(lái)，冷凍保存的外周血單核細(xì)胞 (PBMC) 在免疫分析中的應(yīng)用急劇增加。冷凍保存的PBMC在終點(diǎn)頻率較低的臨床試驗(yàn)中特別有用，因?yàn)榭梢栽谘芯拷Y(jié)束后進(jìn)行免疫分析。此外，使用冷凍保存的PBMC可以在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行所有檢測(cè)，消除了實(shí)驗(yàn)室間變異性，使用冷凍PBMC還可以消除批間變異的影響。
 

除了解決儲(chǔ)存條件的問(wèn)題以外，PBMC細(xì)胞最大的特性是在復(fù)蘇后極易結(jié)團(tuán)，容易導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)量低，檢測(cè)結(jié)果不可信。在細(xì)胞復(fù)蘇的時(shí)候?qū)⑷�能核酸酶加入到培養(yǎng)基中和細(xì)胞共培養(yǎng)，可以有效防止細(xì)胞結(jié)團(tuán)。

 

圖4.未經(jīng)全能核酸酶處理的過(guò)夜儲(chǔ)存血液的斑點(diǎn)計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，四個(gè)供體有三個(gè)顯著減少，用全能核酸酶處理的過(guò)夜血液PBMC的SFC結(jié)果更接近于從新鮮血液中分離的細(xì)胞獲得的結(jié)果

三，逐典Pannarase全能核酸酶優(yōu)勢(shì)：

1.無(wú)動(dòng)物源性、無(wú)氨芐青霉素

2.杰出單位比酶活、更高效的核酸降解能力

3.先進(jìn)的生產(chǎn)工藝，非傳統(tǒng)His標(biāo)簽純化、排除引入金屬離子風(fēng)險(xiǎn)

4.嚴(yán)格的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，內(nèi)毒水平低，確保單位酶活的準(zhǔn)確性以及批次間穩(wěn)定性

1，全能核酸酶應(yīng)用條件：

全能核酸酶的酶活會(huì)受到多種因素的影響（例如溫度、pH、離子強(qiáng)度等），故用量范圍也會(huì)從0.1 U/mL-250 U/mL不等。因此，不同的操作環(huán)境下酶的最佳濃度不同，需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)置梯度進(jìn)行最佳條件的摸索。

2，應(yīng)用實(shí)例：

1.樣品：狂犬病毒濃縮液

處理?xiàng)l件:核酸酶濃度50~90U/ml ,

37 ℃處理 2 h,轉(zhuǎn)入18 ~ 26 ℃處理 6h

 

表 1.不同酶濃度對(duì)狂犬病病毒收獲液中 Vero 細(xì)胞 DNA 的去除效果【11

2.樣品：狂犬病病毒濃縮液

處理?xiàng)l件：25、50和100 U/ml，37℃

 

表 2.不同濃度核酸酶作用不同時(shí)間去除 Vero 細(xì)胞 DNA 效果的比較【2]

 

3.樣品：流感病毒濃縮液

處理?xiàng)l件：10 U/mL，37℃

 

表 3.核酸酶處理 300k 超濾濃縮效果(x± s，n=3)【3]