果聚糖測(cè)定方案K-FRUC(含重組菊粉酶和左旋糖酶)使用說(shuō)明書(shū)
果聚糖測(cè)定方案K-FRUC(含重組菊粉酶和左旋糖酶)
每個(gè)試劑盒100次檢測(cè)
AOAC方法
999.03AACC方法
32-32.01法典II類(lèi)方法
簡(jiǎn)介:
果聚糖被定義為一個(gè)或多個(gè)果糖基-果糖鍵構(gòu)成大部分鍵的任何化合物1。這是指聚臺(tái)物材料以及與二糖,菊粉糖一樣小的低聚物。該定義中包含的材料可能包含也可能不包含D-葡萄糖基取代基。果聚糖研究人員使用術(shù)語(yǔ)低聚物和聚合物來(lái)區(qū)分可以特定表征的材料和不能表征的材料1。果聚糖在植物界廣泛分布。它們存在于單子葉物，雙子葉植物和綠藻中果聚糖的分子結(jié)構(gòu)和分子量不同。它們可分為三種主要類(lèi)型:菊粉基團(tuán),果聚糖基團(tuán)和分支基團(tuán)。菊粉組由主要或完全具有(2→1)果糖基果糖鍵。Levan是一種主要或完全含有(2→6)果糖基果糖鍵。支鏈基團(tuán)具有大量的（2→1）和（2→6）果糖基-果糖鍵（例如來(lái)自禾本科的禾本素）。
已經(jīng)描述了幾種用于測(cè)量植物材料和食品中果聚糖的方法,但通常認(rèn)為它們最好在水解成D-果糖和D-葡萄糖后測(cè)量。這引入了獨(dú)立去除或測(cè)量蔗糖,D-果糖和D-葡萄糖的挑戰(zhàn)。Pontis(1966)2用結(jié)晶酵母轉(zhuǎn)化酶水解蔗糖,并通過(guò)用氫氧化鈉煮沸破壞所得的D-葡萄糖和D-果糖以及現(xiàn)有的單糖。然而,酵母轉(zhuǎn)化酶也水解較低聚合度(DP)的低聚果糖(FOS )。濃度為10 mg/mL時(shí) ,1-酮糖的水解率約為蔗糖的20% ,1,1-酮四糖的水解率約為蔗糖的10%。3
在McCleary和Blakeney(1999)引入的果聚糖測(cè)定程序中,樣品中的蔗糖用特定的蔗糖酶水解,釋放的D-葡萄糖和D-果糖以及樣品中的所有其他還原糖通過(guò)硼氫化物還原成相應(yīng)的糖醇(不用PAHBAH試劑測(cè)量)。然后用高度純化的內(nèi)菊粉酶和外菊粉酶菊型和支鏈型果聚糖水解成D-葡萄糖和D-果糖。隨后,重組產(chǎn)生超純的外切和內(nèi)切菊粉酸并將其引入該方法。這些酶的使用消除了痕量B-葡萄糖苷酶和非重組酶中存在的B-葡糖寡糖部分水解的問(wèn)題。在最近的發(fā)展中,重組內(nèi)切果聚糖酶已被摻入果聚糖酶混合物中,將該方法的使用擴(kuò)展到測(cè)量草中存在的果聚糖型果聚糖,如蒂莫西,雞冠,黑麥草和紅羊茅。在沒(méi)有內(nèi)切果聚糖酶的情況下,果聚糖型果聚糖被低估了(表1)4，5
本手冊(cè)中描述的方法采用超純重組酶，專(zhuān)門(mén)測(cè)量菊苣、大麗花、菊芋中的菊粉型果聚糖等果聚糖；洋蔥和小麥莖葉中高度分枝的果聚糖；以及來(lái)自帝汶草等牧草的levan型果聚糖。這種方法低估了商業(yè)上部分水解的果聚糖產(chǎn)品，如Raftilose P-95®（約20%），其程度與果聚糖的水解程度有關(guān)。如果果聚糖/FOS成分的樣本可用，則很容易通過(guò)分析確定實(shí)際低估的程度（見(jiàn)附錄A）。龍舌蘭果聚糖是定量測(cè)量的。商業(yè)龍舌蘭果聚糖制劑含有高達(dá)20%的果糖、葡萄糖和蔗糖（蔗糖不是果聚糖，因此未被測(cè)量）。
原理：
蔗糖被一種特定的蔗糖酶水解，這種酶對(duì)低聚合度（DP）的FOS（如1-果糖和1,1-酮四糖）沒(méi)有作用3。淀粉和麥芽糊精被普魯蘭酶和β-淀粉酶水解為麥芽糖和麥芽三糖，然后這些低聚糖被麥芽糖酶水解為D-葡萄糖（1&2）。由于蔗糖酶在30°C下更穩(wěn)定，因此現(xiàn)在這是該培養(yǎng)步驟的推薦溫度。
D-葡萄糖和D-果糖被硼氫化鈉還原為相應(yīng)的糖醇、D-山梨醇和D-甘露醇。在這個(gè)反應(yīng)中，水解菊粉制劑中低聚果糖還原端的D-果糖基殘留物也被還原為糖醇。天然果聚糖和非還原性FOS，如Neosugs®，不受此反應(yīng)的影響（3）。
FOS、果聚糖和硼氫化物還原的FOS被內(nèi)切和內(nèi)切菊粉酶和內(nèi)切左旋酶特異性水解為D-葡萄糖和D-果糖（4）。
使用PAHBAH還原糖法測(cè)量來(lái)自果聚糖的D-果糖和D-葡萄糖。6這種方法使用簡(jiǎn)單，D-果糖和D-葡萄糖的顏色響應(yīng)相同（5）。
特異性、敏感性、線性和精密度：
該測(cè)定是在AOAC International和AACC International的主持下成功進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)室間評(píng)估的主題。7該測(cè)定對(duì)所有類(lèi)型的果聚糖都有特異性，包括：；主要或僅含有（2→1）果糖基-果糖鍵（菊粉）的那些；具有大量（2→1）和（2→6）果糖基-果糖鍵的那些（例如來(lái)自洋蔥、禾本科和龍舌蘭的那些）；以及主要或僅含有（2-6）果糖基-果糖鍵（levan）的那些。硼氫化物還原的FOS被水解，從“還原端”末端釋放出D-甘露醇。谷物中果聚糖的微量水平可以通過(guò)混合連接β-葡聚糖的部分水解來(lái)測(cè)量，而不會(huì)降低糖水平。如果樣品可能含有半乳糖基蔗糖低聚糖（如棉子糖），應(yīng)通過(guò)α-半乳糖苷酶水解將其去除。
該測(cè)定的最小區(qū)分吸光度為0.010吸光度單位。這相當(dāng)于被分析樣品提取物中12.8μg/mL的D-葡萄糖和D-果糖。
檢測(cè)限為每毫升樣品提取物25.6μg D-果糖和/或D-葡萄糖，這是由0.02的測(cè)定吸光度差得出的。
該測(cè)定在每次測(cè)定2.3至55μg D-果糖或D-葡萄糖的范圍內(nèi)呈線性。在使用一種樣品溶液進(jìn)行兩次測(cè)定時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)0.005至0.010的吸光度差，這對(duì)應(yīng)于每次測(cè)定的D-果糖或D-葡萄糖水平為0.023-0.046μg。
干擾：
被分析樣品中的干擾物質(zhì)可以通過(guò)加入菊粉或左旋內(nèi)標(biāo)來(lái)識(shí)別。預(yù)計(jì)該標(biāo)準(zhǔn)的定量回收。樣品處理和提取過(guò)程中的損失是通過(guò)進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)來(lái)識(shí)別的，即在初始提取步驟中向樣品中添加菊粉或果聚糖。
安全：用于測(cè)定果聚糖的試劑不是《危險(xiǎn)物質(zhì)條例》意義上的危險(xiǎn)物質(zhì)。應(yīng)遵守適用于化學(xué)物質(zhì)的一般安全措施。
套件內(nèi)容：
Megazyme提供適用于進(jìn)行100次檢測(cè)的試劑盒。試劑盒包含完整的檢測(cè)方法以及：
瓶子1. 蔗糖酶加β-淀粉酶、普魯蘭酶和麥芽糖酶凍干粉。儲(chǔ)存溫度低于-10°C。有效期見(jiàn)單獨(dú)標(biāo)簽。
瓶子2. 果糖酶。凍干粉狀重組外旋和內(nèi)切菊粉酶以及重組內(nèi)切（x2）左旋酯酶。儲(chǔ)存溫度低于-10°C。有效期見(jiàn)單獨(dú)標(biāo)簽。
瓶子3. 菊粉控制面粉。菊粉在α-纖維素存在下冷凍干燥。在室溫下儲(chǔ)存。有效期見(jiàn)單獨(dú)標(biāo)簽。
瓶子4. Levan控制面粉。提摩太草在α-纖維素存在下凍干。在室溫下儲(chǔ)存。有效期見(jiàn)單獨(dú)標(biāo)簽。
瓶子5. 蔗糖控制面粉。蔗糖在α-纖維素存在下冷凍干燥。在室溫下儲(chǔ)存。有效期見(jiàn)單獨(dú)標(biāo)簽。
瓶子6. D-果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.5 mg/mL）在0.2%（w/v）苯甲酸中的溶液。在室溫下儲(chǔ)存。有效期見(jiàn)單獨(dú)標(biāo)簽。
酶的制備：
1.將瓶子1的內(nèi)容物（蔗糖酶和β-淀粉酶等）溶解在22 mL緩沖液1中[馬來(lái)酸鈉（100 mM，pH 6.5加牛血清白蛋白（0.5 mg/mL）]（酶溶液A）。分成適當(dāng)體積的等分試樣，儲(chǔ)存在聚丙烯管中。
在-10°C以下穩(wěn)定≤2年。
2. 將瓶子2（果糖酶）中的一個(gè)內(nèi)容物溶解在11 mL緩沖液2[乙酸鈉（100 mM，pH 4.5）]中。這是酶溶液B。分成適當(dāng)體積的等分試樣，儲(chǔ)存在聚丙烯管中。在-10°C以下穩(wěn)定4個(gè)月。在需要之前，不要溶解剩余的瓶子2（果聚糖酶）。
注意：重新懸浮瓶子2（果糖酶）所需的體積與AOAC方法（999.032016.142018.07）中所述的體積不同，但所得酶溶液B的濃度保持不變。因此，它可以在這些方法的其余步驟中正常使用。
3、4、5使用提供的瓶子3、4，5和6中的內(nèi)容物。
&6在室溫下穩(wěn)定>5年。
緩沖液（未提供）：
緩沖液1：馬來(lái)酸鈉緩沖液（100 mM，pH 6.5）
將馬來(lái)酸（11.6 g，Sigma目錄號(hào)M0375）溶解在900 mL蒸餾水中，用氫氧化鈉溶液（2 M）將pH值調(diào)節(jié)至6.5。將音量調(diào)節(jié)到1升。
向100 mL該緩沖液中加入50 mg牛血清白蛋白，使?jié)舛冗_(dá)到0.5 mg/mL。該緩沖液用于溶解瓶子1（蔗糖酶制劑）。緩沖液應(yīng)存放在-10°C以下。
緩沖液2：醋酸鈉緩沖液（100 mM，pH 4.5）
將冰醋酸（5.8 mL）加入900 mL蒸餾水中。使用1M氫氧化鈉將pH值調(diào)節(jié)至4.5。將音量調(diào)節(jié)到1升。這是緩沖液2。
試劑（未提供）：
1.PAHBAH還原糖測(cè)定試劑
溶液A.在磁力攪拌器上的250毫升燒杯中，將10克對(duì)羥基苯甲酸酰肼（Sigma目錄號(hào)H9882-100G）（PAHBAH）加入60毫升蒸餾水中。攪拌漿液，加入10mL濃鹽酸。用蒸餾水將溶液的體積調(diào)節(jié)至200毫升。
溶液B.將24.9 g檸檬酸三鈉二水合物（MW=294.1）加入500 mL蒸餾水中并攪拌溶解。加入2.2克二水合氯化鈣（分子量=147.01）并溶解。加入40.0克氫氧化鈉，攪拌溶解（溶液可能呈乳白色，但稀釋至2升后會(huì)澄清）。將音量調(diào)節(jié)到2升。
PAHBAH工作試劑。使用前，將20 mL溶液A加入180 mL溶液B中，并充分混合�；旌先芤涸诒戏�(wěn)定約4小時(shí)。
2.氫氧化鈉（50 mM）
將2.0克氫氧化鈉溶解在900毫升蒸餾水中。將音量調(diào)節(jié)到1升。
3.堿性硼氫化物（在50mM氫氧化鈉中的10mg/mL硼氫化鈉）
精確稱(chēng)取約50mg硼氫化鈉（Sigma目錄號(hào)213462-100G），放入聚丙烯容器（容量10mL，帶螺帽）中。記錄試管上的確切重量（為方便起見(jiàn)，約為10），密封試管并將其儲(chǔ)存在干燥器中以備將來(lái)使用。在室溫下穩(wěn)定2年以上。
使用前，將硼氫化鈉（10mg/mL）溶解在50mM氫氧化鈉中。該溶液在室溫下穩(wěn)定4-5小時(shí)。這是試劑3（堿性硼氫化物溶液）。
4.乙酸（200 mM）
將11.6 mL冰醋酸加入600 mL蒸餾水中，并將體積調(diào)節(jié)至1 L。這是試劑4（200 mM醋酸）。
設(shè)備（推薦）：
1.玻璃試管（圓底；16 x 100 mm）。
2.帶PTFE內(nèi)襯酚醛蓋的Pyrex螺旋蓋培養(yǎng)管（25 x 150 mm）（Fisher目錄號(hào)14-933D）。
3.微量移液器，例如Gilson Pipetman®（100μL和200μL）。
4.正排量移液器，例如Eppendorf Multipete®
-使用5.0 mL Combitip®（分配0.2 mL等分蔗糖酶混合物和0.1 mL等分果糖，以及其他溶液和緩沖液）。
-使用50 mL Combitip®（分配5.0 mL PAHBAH工作試劑等分試樣）。
5.Brand®Dispensette®S數(shù)字瓶蓋分配器（2.5-25mL）（Sigma目錄號(hào)BR4600351）。
-分配10mL 200mM乙酸鈉緩沖液（pH 5.0）。
6.分析天平。
7.分光光度計(jì)設(shè)置為410 nm。
8.渦流混合器（例如Vortex Genie®2混合器）。
9.恒溫水�。ㄔO(shè)置為30°C和40°C）。
10.沸水浴。
11.微型離心機(jī)（所需轉(zhuǎn)速13000 rpm）。
12.一次性1.5毫升聚丙烯微量離心管，如Sarstedt Cat No.72.690（www.sarstedt.com）。
13.計(jì)數(shù)器。
控制和預(yù)防措施：
1.使用PAHBAH試劑在100°C下孵育的時(shí)間至關(guān)重要，應(yīng)使用秒表計(jì)時(shí)。
2.在每組測(cè)定中，應(yīng)同時(shí)包括試劑空白和D-果糖對(duì)照并進(jìn)行分析。
a） 試劑空白由0.3 mL 100 mM醋酸鈉緩沖液（緩沖液2）和5.0 mL PAHBAH工作試劑組成。
b） 通過(guò)將0.2 mL D-果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.5 mg/mL）加入0.9 mL 100 mM乙酸鈉（pH 4.5）（緩沖液2）中并充分混合來(lái)制備D-果糖對(duì)照品。將0.2 mL等分的該溶液（含54.5μg D-果糖）分為四份，放入玻璃試管（16 x 100 mm）中。向每個(gè)試管中加入0.1 mL緩沖液2和5.0 mL PAHBAH工作試劑（在沸水浴中孵育之前）。
3.每組測(cè)定都包括菊粉/纖維素對(duì)照粉末和/或果聚糖/纖維素對(duì)照粉。藥瓶標(biāo)簽上標(biāo)明了這些粉末的果聚糖含量。
4.每批新試劑都應(yīng)分析蔗糖/纖維素對(duì)照粉末。如果蔗糖酶處理步驟完全有效，則測(cè)定的果聚糖值應(yīng)為約0.2%（w/w）。如果蔗糖酶無(wú)效，測(cè)定值將反映對(duì)照蔗糖/纖維素粉末的蔗糖含量[約10%（w/w）；見(jiàn)小瓶標(biāo)簽]。
5.D-果糖對(duì)照品（一式四份）和試劑空白溶液（一式兩份）與每批樣品一起運(yùn)行，并與樣品同時(shí)在沸水浴中孵育。
6.可以使用D-果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2 mL，1.5 mg/mL）并從測(cè)定程序的步驟B.1（第8頁(yè)）開(kāi)始檢查硼氫化物還原的有效性。用果聚糖酶處理（步驟C.2）改為加入醋酸鹽緩沖液（0.1 mL，0.1 M，pH 4.5）。用PAHBAH工作試劑孵育后，溶液應(yīng)無(wú)色。
7.如果被分析的樣品含有半乳糖基蔗糖低聚糖，可以通過(guò)與黑曲霉α-半乳糖苷酶（Megazyme cat.no.E AGLANP）孵育將其去除。請(qǐng)參閱Megazyme網(wǎng)站上K-FRUC下的常見(jiàn)問(wèn)題（FAQ）。
測(cè)定程序：
將干燥樣品研磨以通過(guò)0.5毫米的篩網(wǎng)。用鋒利的刀將固體脂肪樣品（如巧克力）切成細(xì)小的刨花；軟食品（如涂抹食品）無(wú)需進(jìn)一步準(zhǔn)備即可進(jìn)行分析。所有樣品在稱(chēng)重前應(yīng)在室溫下進(jìn)行。
A.果聚糖提取
含有0-10%（w/w）果聚糖的樣品
準(zhǔn)確稱(chēng)取約400mg樣品放入干燥的pyrex螺旋蓋培養(yǎng)管（25 x 150 mm）中，并加入25 mL蒸餾水。松松地蓋住管子。將試管放入沸水浴中加熱10分鐘。5分鐘后，擰緊管帽，通過(guò)倒置和搖晃試管劇烈混合內(nèi)容物。將試管放回沸水浴中。再過(guò)5分鐘后，將試管從沸水浴中取出，通過(guò)倒置和搖動(dòng)再次混合內(nèi)容物。
含有10-40%（w/w）果聚糖的樣品
準(zhǔn)確稱(chēng)取約100mg樣品，放入干燥的pyrex螺旋蓋培養(yǎng)基中 試管（25 x 150 mm）并加入25 mL蒸餾水。松松地蓋住管子。放置 將試管放入沸水浴中加熱10分鐘。5分鐘后，擰緊 蓋上管帽，通過(guò)倒置和搖晃劇烈混合內(nèi)容物。放回試管 放入沸水浴中。再過(guò)5分鐘后，將試管從沸騰中取出 水浴，通過(guò)倒置和搖動(dòng)再次混合內(nèi)容物。在每種情況下，讓試管內(nèi)容物冷卻至室溫，然后轉(zhuǎn)移~ 2.0 mL放入2.0 mL微量離心管中，以13000 rpm離心5分鐘。
注意：對(duì)于含有40-100%（w/w）果聚糖的樣品，加入1 mL離心提取物 加入2mL水中并進(jìn)行測(cè)定。
B. 去除蔗糖、淀粉和還原糖：
注意：如果樣品中蔗糖和麥芽糊精含量很高（例如嬰兒 牛奶配方），將孵化時(shí)間延長(zhǎng)至60分鐘，以確保完全 這些低聚糖的水解。 在每種情況下，讓試管內(nèi)容物冷卻至室溫，然后轉(zhuǎn)移~ 2.0 mL放入2.0 mL微量離心管中，以13000 rpm離心5分鐘。
3.向試管中加入0.2 mL試劑3（堿性硼氫化物溶液），劇烈攪拌 并用Parafilm®覆蓋管子。將試管在40°C下孵育30分鐘以達(dá)到效果 將還原糖完全還原為糖醇。
4.在試管中加入0.5mL試劑4（200mM乙酸），并在攪拌下劇烈攪拌 渦流混合器。應(yīng)觀察到強(qiáng)烈的泡騰（這種治療可以消除 過(guò)量硼氫化物并將pH值調(diào)節(jié)至約4.5）。這被稱(chēng)為解決方案S。
C.果聚糖的水解和測(cè)定：
1.準(zhǔn)確小心地將0.2 mL等分溶液S轉(zhuǎn)移到3個(gè)玻璃杯的底部 試管（16 x 100毫米）。
2.向其中2個(gè)試管中加入0.1mL果糖溶液（酶溶液B） （樣品）和0.1mL緩沖液2（100mM乙酸鈉）至第三個(gè)（樣品） 空白）。
3.將試管在40°C下孵育30分鐘，使果聚糖完全水解為D-果糖和D-葡萄糖。在培養(yǎng)過(guò)程中用Parafilm®密封試管。
4.向所有試管中加入5.0 mL PAHBAH工作試劑[樣品、樣品空白、D-果糖標(biāo)準(zhǔn)品（見(jiàn)對(duì)照和注意事項(xiàng)2.b）、試劑空白（對(duì)照和 注意事項(xiàng)2.a）和菊粉/纖維素對(duì)照提取物和/或果聚糖/ 纖維素控制]并在沸水浴中孵育6分鐘。
5.從沸水浴中取出管子，立即將其放入冷水中 將水（18-20°C）加熱約5分鐘。
6.測(cè)量所有溶液在410nm處相對(duì)于試劑空白的吸光度。 冷卻試管后盡快測(cè)量吸光度值。PAHBAH 顏色復(fù)合體會(huì)隨著時(shí)間的推移而褪色。
計(jì)算：
果聚糖（%w/w）：
其中：
ΔA=樣品吸光度-樣品空白吸光度（兩者均與試劑空白相對(duì)）
F=將吸光度值轉(zhuǎn)換為μg D-果糖的系數(shù)
=（54.5μg D-果糖）/（54.5微克D-果糖的吸光度）
5=從測(cè)定的0.2 mL轉(zhuǎn)換為1.0 mL的系數(shù)
25=所用萃取劑的體積（mL）
1.1/0.2=從1.1mL酶消化液中取出0.2mL用于分析
W=提取樣品的重量（mg）（即100或200mg）
100/W=表示果聚糖占樣品重量百分比的系數(shù)
1/1000=從μg轉(zhuǎn)換為mg的系數(shù)
162/180=從游離D-果糖轉(zhuǎn)化為果糖酐（和葡萄糖酐）的因子，如
D=樣品提取物的進(jìn)一步稀釋
注意：使用Megazyme Mega-Calc™可以簡(jiǎn)化這些計(jì)算， 可從Megazyme網(wǎng)站上的產(chǎn)品顯示處下載 （www.megazyme.com）。
表1.用外加內(nèi)切菊粉酶測(cè)定各種樣品的果聚糖含量 并且不添加內(nèi)切左旋酯酶。
附錄：
A. 確定由于以下原因而低估果聚糖含量的程度 水解菊粉的硼氫化物還原：
玻璃試管（16 x 120 mm），加入0.9 mL pH 4.5的100 mm醋酸鈉緩沖液（緩沖液2）在劇烈攪拌下加入試管中。
6.準(zhǔn)確小心地將0.2 mL等分溶液轉(zhuǎn)移到
三個(gè)玻璃試管（16 x 100 mm），按照以下步驟進(jìn)行果聚糖水解標(biāo)準(zhǔn)果聚糖程序；步驟C.2至C.6。這給了非硼氫化物還原的果聚糖樣品（NBRF）的吸光度。按照以下計(jì)算硼氫化物還原后標(biāo)準(zhǔn)程序中果聚糖的回收率百分比如下：
回收率=吸光度BRF/吸光度NBRF x 100
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每個(gè)試劑盒100次檢測(cè)
AOAC方法
999.03AACC方法
32-32.01法典II類(lèi)方法
簡(jiǎn)介:
果聚糖被定義為一個(gè)或多個(gè)果糖基-果糖鍵構(gòu)成大部分鍵的任何化合物1。這是指聚臺(tái)物材料以及與二糖,菊粉糖一樣小的低聚物。該定義中包含的材料可能包含也可能不包含D-葡萄糖基取代基。果聚糖研究人員使用術(shù)語(yǔ)低聚物和聚合物來(lái)區(qū)分可以特定表征的材料和不能表征的材料1。果聚糖在植物界廣泛分布。它們存在于單子葉物，雙子葉植物和綠藻中果聚糖的分子結(jié)構(gòu)和分子量不同。它們可分為三種主要類(lèi)型:菊粉基團(tuán),果聚糖基團(tuán)和分支基團(tuán)。菊粉組由主要或完全具有(2→1)果糖基果糖鍵。Levan是一種主要或完全含有(2→6)果糖基果糖鍵。支鏈基團(tuán)具有大量的（2→1）和（2→6）果糖基-果糖鍵（例如來(lái)自禾本科的禾本素）。
已經(jīng)描述了幾種用于測(cè)量植物材料和食品中果聚糖的方法,但通常認(rèn)為它們最好在水解成D-果糖和D-葡萄糖后測(cè)量。這引入了獨(dú)立去除或測(cè)量蔗糖,D-果糖和D-葡萄糖的挑戰(zhàn)。Pontis(1966)2用結(jié)晶酵母轉(zhuǎn)化酶水解蔗糖,并通過(guò)用氫氧化鈉煮沸破壞所得的D-葡萄糖和D-果糖以及現(xiàn)有的單糖。然而,酵母轉(zhuǎn)化酶也水解較低聚合度(DP)的低聚果糖(FOS )。濃度為10 mg/mL時(shí) ,1-酮糖的水解率約為蔗糖的20% ,1,1-酮四糖的水解率約為蔗糖的10%。3
在McCleary和Blakeney(1999)引入的果聚糖測(cè)定程序中,樣品中的蔗糖用特定的蔗糖酶水解,釋放的D-葡萄糖和D-果糖以及樣品中的所有其他還原糖通過(guò)硼氫化物還原成相應(yīng)的糖醇(不用PAHBAH試劑測(cè)量)。然后用高度純化的內(nèi)菊粉酶和外菊粉酶菊型和支鏈型果聚糖水解成D-葡萄糖和D-果糖。隨后,重組產(chǎn)生超純的外切和內(nèi)切菊粉酸并將其引入該方法。這些酶的使用消除了痕量B-葡萄糖苷酶和非重組酶中存在的B-葡糖寡糖部分水解的問(wèn)題。在最近的發(fā)展中,重組內(nèi)切果聚糖酶已被摻入果聚糖酶混合物中,將該方法的使用擴(kuò)展到測(cè)量草中存在的果聚糖型果聚糖,如蒂莫西,雞冠,黑麥草和紅羊茅。在沒(méi)有內(nèi)切果聚糖酶的情況下,果聚糖型果聚糖被低估了(表1)4，5
本手冊(cè)中描述的方法采用超純重組酶，專(zhuān)門(mén)測(cè)量菊苣、大麗花、菊芋中的菊粉型果聚糖等果聚糖；洋蔥和小麥莖葉中高度分枝的果聚糖；以及來(lái)自帝汶草等牧草的levan型果聚糖。這種方法低估了商業(yè)上部分水解的果聚糖產(chǎn)品，如Raftilose P-95®（約20%），其程度與果聚糖的水解程度有關(guān)。如果果聚糖/FOS成分的樣本可用，則很容易通過(guò)分析確定實(shí)際低估的程度（見(jiàn)附錄A）。龍舌蘭果聚糖是定量測(cè)量的。商業(yè)龍舌蘭果聚糖制劑含有高達(dá)20%的果糖、葡萄糖和蔗糖（蔗糖不是果聚糖，因此未被測(cè)量）。
原理：
蔗糖被一種特定的蔗糖酶水解，這種酶對(duì)低聚合度（DP）的FOS（如1-果糖和1,1-酮四糖）沒(méi)有作用3。淀粉和麥芽糊精被普魯蘭酶和β-淀粉酶水解為麥芽糖和麥芽三糖，然后這些低聚糖被麥芽糖酶水解為D-葡萄糖（1&2）。由于蔗糖酶在30°C下更穩(wěn)定，因此現(xiàn)在這是該培養(yǎng)步驟的推薦溫度。
D-葡萄糖和D-果糖被硼氫化鈉還原為相應(yīng)的糖醇、D-山梨醇和D-甘露醇。在這個(gè)反應(yīng)中，水解菊粉制劑中低聚果糖還原端的D-果糖基殘留物也被還原為糖醇。天然果聚糖和非還原性FOS，如Neosugs®，不受此反應(yīng)的影響（3）。
FOS、果聚糖和硼氫化物還原的FOS被內(nèi)切和內(nèi)切菊粉酶和內(nèi)切左旋酶特異性水解為D-葡萄糖和D-果糖（4）。
使用PAHBAH還原糖法測(cè)量來(lái)自果聚糖的D-果糖和D-葡萄糖。6這種方法使用簡(jiǎn)單，D-果糖和D-葡萄糖的顏色響應(yīng)相同（5）。
特異性、敏感性、線性和精密度：
該測(cè)定是在AOAC International和AACC International的主持下成功進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)室間評(píng)估的主題。7該測(cè)定對(duì)所有類(lèi)型的果聚糖都有特異性，包括：；主要或僅含有（2→1）果糖基-果糖鍵（菊粉）的那些；具有大量（2→1）和（2→6）果糖基-果糖鍵的那些（例如來(lái)自洋蔥、禾本科和龍舌蘭的那些）；以及主要或僅含有（2-6）果糖基-果糖鍵（levan）的那些。硼氫化物還原的FOS被水解，從“還原端”末端釋放出D-甘露醇。谷物中果聚糖的微量水平可以通過(guò)混合連接β-葡聚糖的部分水解來(lái)測(cè)量，而不會(huì)降低糖水平。如果樣品可能含有半乳糖基蔗糖低聚糖（如棉子糖），應(yīng)通過(guò)α-半乳糖苷酶水解將其去除。
該測(cè)定的最小區(qū)分吸光度為0.010吸光度單位。這相當(dāng)于被分析樣品提取物中12.8μg/mL的D-葡萄糖和D-果糖。
檢測(cè)限為每毫升樣品提取物25.6μg D-果糖和/或D-葡萄糖，這是由0.02的測(cè)定吸光度差得出的。
該測(cè)定在每次測(cè)定2.3至55μg D-果糖或D-葡萄糖的范圍內(nèi)呈線性。在使用一種樣品溶液進(jìn)行兩次測(cè)定時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)0.005至0.010的吸光度差，這對(duì)應(yīng)于每次測(cè)定的D-果糖或D-葡萄糖水平為0.023-0.046μg。
干擾：
被分析樣品中的干擾物質(zhì)可以通過(guò)加入菊粉或左旋內(nèi)標(biāo)來(lái)識(shí)別。預(yù)計(jì)該標(biāo)準(zhǔn)的定量回收。樣品處理和提取過(guò)程中的損失是通過(guò)進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)來(lái)識(shí)別的，即在初始提取步驟中向樣品中添加菊粉或果聚糖。
安全：用于測(cè)定果聚糖的試劑不是《危險(xiǎn)物質(zhì)條例》意義上的危險(xiǎn)物質(zhì)。應(yīng)遵守適用于化學(xué)物質(zhì)的一般安全措施。
套件內(nèi)容：
Megazyme提供適用于進(jìn)行100次檢測(cè)的試劑盒。試劑盒包含完整的檢測(cè)方法以及：
瓶子1. 蔗糖酶加β-淀粉酶、普魯蘭酶和麥芽糖酶凍干粉。儲(chǔ)存溫度低于-10°C。有效期見(jiàn)單獨(dú)標(biāo)簽。
瓶子2. 果糖酶。凍干粉狀重組外旋和內(nèi)切菊粉酶以及重組內(nèi)切（x2）左旋酯酶。儲(chǔ)存溫度低于-10°C。有效期見(jiàn)單獨(dú)標(biāo)簽。
瓶子3. 菊粉控制面粉。菊粉在α-纖維素存在下冷凍干燥。在室溫下儲(chǔ)存。有效期見(jiàn)單獨(dú)標(biāo)簽。
瓶子4. Levan控制面粉。提摩太草在α-纖維素存在下凍干。在室溫下儲(chǔ)存。有效期見(jiàn)單獨(dú)標(biāo)簽。
瓶子5. 蔗糖控制面粉。蔗糖在α-纖維素存在下冷凍干燥。在室溫下儲(chǔ)存。有效期見(jiàn)單獨(dú)標(biāo)簽。
瓶子6. D-果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.5 mg/mL）在0.2%（w/v）苯甲酸中的溶液。在室溫下儲(chǔ)存。有效期見(jiàn)單獨(dú)標(biāo)簽。
酶的制備：
1.將瓶子1的內(nèi)容物（蔗糖酶和β-淀粉酶等）溶解在22 mL緩沖液1中[馬來(lái)酸鈉（100 mM，pH 6.5加牛血清白蛋白（0.5 mg/mL）]（酶溶液A）。分成適當(dāng)體積的等分試樣，儲(chǔ)存在聚丙烯管中。
在-10°C以下穩(wěn)定≤2年。
2. 將瓶子2（果糖酶）中的一個(gè)內(nèi)容物溶解在11 mL緩沖液2[乙酸鈉（100 mM，pH 4.5）]中。這是酶溶液B。分成適當(dāng)體積的等分試樣，儲(chǔ)存在聚丙烯管中。在-10°C以下穩(wěn)定4個(gè)月。在需要之前，不要溶解剩余的瓶子2（果聚糖酶）。
注意：重新懸浮瓶子2（果糖酶）所需的體積與AOAC方法（999.032016.142018.07）中所述的體積不同，但所得酶溶液B的濃度保持不變。因此，它可以在這些方法的其余步驟中正常使用。
3、4、5使用提供的瓶子3、4，5和6中的內(nèi)容物。
&6在室溫下穩(wěn)定>5年。
緩沖液（未提供）：
緩沖液1：馬來(lái)酸鈉緩沖液（100 mM，pH 6.5）
將馬來(lái)酸（11.6 g，Sigma目錄號(hào)M0375）溶解在900 mL蒸餾水中，用氫氧化鈉溶液（2 M）將pH值調(diào)節(jié)至6.5。將音量調(diào)節(jié)到1升。
向100 mL該緩沖液中加入50 mg牛血清白蛋白，使?jié)舛冗_(dá)到0.5 mg/mL。該緩沖液用于溶解瓶子1（蔗糖酶制劑）。緩沖液應(yīng)存放在-10°C以下。
緩沖液2：醋酸鈉緩沖液（100 mM，pH 4.5）
將冰醋酸（5.8 mL）加入900 mL蒸餾水中。使用1M氫氧化鈉將pH值調(diào)節(jié)至4.5。將音量調(diào)節(jié)到1升。這是緩沖液2。
試劑（未提供）：
1.PAHBAH還原糖測(cè)定試劑
溶液A.在磁力攪拌器上的250毫升燒杯中，將10克對(duì)羥基苯甲酸酰肼（Sigma目錄號(hào)H9882-100G）（PAHBAH）加入60毫升蒸餾水中。攪拌漿液，加入10mL濃鹽酸。用蒸餾水將溶液的體積調(diào)節(jié)至200毫升。
溶液B.將24.9 g檸檬酸三鈉二水合物（MW=294.1）加入500 mL蒸餾水中并攪拌溶解。加入2.2克二水合氯化鈣（分子量=147.01）并溶解。加入40.0克氫氧化鈉，攪拌溶解（溶液可能呈乳白色，但稀釋至2升后會(huì)澄清）。將音量調(diào)節(jié)到2升。
PAHBAH工作試劑。使用前，將20 mL溶液A加入180 mL溶液B中，并充分混合�；旌先芤涸诒戏�(wěn)定約4小時(shí)。
2.氫氧化鈉（50 mM）
將2.0克氫氧化鈉溶解在900毫升蒸餾水中。將音量調(diào)節(jié)到1升。
3.堿性硼氫化物（在50mM氫氧化鈉中的10mg/mL硼氫化鈉）
精確稱(chēng)取約50mg硼氫化鈉（Sigma目錄號(hào)213462-100G），放入聚丙烯容器（容量10mL，帶螺帽）中。記錄試管上的確切重量（為方便起見(jiàn)，約為10），密封試管并將其儲(chǔ)存在干燥器中以備將來(lái)使用。在室溫下穩(wěn)定2年以上。
使用前，將硼氫化鈉（10mg/mL）溶解在50mM氫氧化鈉中。該溶液在室溫下穩(wěn)定4-5小時(shí)。這是試劑3（堿性硼氫化物溶液）。
4.乙酸（200 mM）
將11.6 mL冰醋酸加入600 mL蒸餾水中，并將體積調(diào)節(jié)至1 L。這是試劑4（200 mM醋酸）。
設(shè)備（推薦）：
1.玻璃試管（圓底；16 x 100 mm）。
2.帶PTFE內(nèi)襯酚醛蓋的Pyrex螺旋蓋培養(yǎng)管（25 x 150 mm）（Fisher目錄號(hào)14-933D）。
3.微量移液器，例如Gilson Pipetman®（100μL和200μL）。
4.正排量移液器，例如Eppendorf Multipete®
-使用5.0 mL Combitip®（分配0.2 mL等分蔗糖酶混合物和0.1 mL等分果糖，以及其他溶液和緩沖液）。
-使用50 mL Combitip®（分配5.0 mL PAHBAH工作試劑等分試樣）。
5.Brand®Dispensette®S數(shù)字瓶蓋分配器（2.5-25mL）（Sigma目錄號(hào)BR4600351）。
-分配10mL 200mM乙酸鈉緩沖液（pH 5.0）。
6.分析天平。
7.分光光度計(jì)設(shè)置為410 nm。
8.渦流混合器（例如Vortex Genie®2混合器）。
9.恒溫水�。ㄔO(shè)置為30°C和40°C）。
10.沸水浴。
11.微型離心機(jī)（所需轉(zhuǎn)速13000 rpm）。
12.一次性1.5毫升聚丙烯微量離心管，如Sarstedt Cat No.72.690（www.sarstedt.com）。
13.計(jì)數(shù)器。
控制和預(yù)防措施：
1.使用PAHBAH試劑在100°C下孵育的時(shí)間至關(guān)重要，應(yīng)使用秒表計(jì)時(shí)。
2.在每組測(cè)定中，應(yīng)同時(shí)包括試劑空白和D-果糖對(duì)照并進(jìn)行分析。
a） 試劑空白由0.3 mL 100 mM醋酸鈉緩沖液（緩沖液2）和5.0 mL PAHBAH工作試劑組成。
b） 通過(guò)將0.2 mL D-果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.5 mg/mL）加入0.9 mL 100 mM乙酸鈉（pH 4.5）（緩沖液2）中并充分混合來(lái)制備D-果糖對(duì)照品。將0.2 mL等分的該溶液（含54.5μg D-果糖）分為四份，放入玻璃試管（16 x 100 mm）中。向每個(gè)試管中加入0.1 mL緩沖液2和5.0 mL PAHBAH工作試劑（在沸水浴中孵育之前）。
3.每組測(cè)定都包括菊粉/纖維素對(duì)照粉末和/或果聚糖/纖維素對(duì)照粉。藥瓶標(biāo)簽上標(biāo)明了這些粉末的果聚糖含量。
4.每批新試劑都應(yīng)分析蔗糖/纖維素對(duì)照粉末。如果蔗糖酶處理步驟完全有效，則測(cè)定的果聚糖值應(yīng)為約0.2%（w/w）。如果蔗糖酶無(wú)效，測(cè)定值將反映對(duì)照蔗糖/纖維素粉末的蔗糖含量[約10%（w/w）；見(jiàn)小瓶標(biāo)簽]。
5.D-果糖對(duì)照品（一式四份）和試劑空白溶液（一式兩份）與每批樣品一起運(yùn)行，并與樣品同時(shí)在沸水浴中孵育。
6.可以使用D-果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2 mL，1.5 mg/mL）并從測(cè)定程序的步驟B.1（第8頁(yè)）開(kāi)始檢查硼氫化物還原的有效性。用果聚糖酶處理（步驟C.2）改為加入醋酸鹽緩沖液（0.1 mL，0.1 M，pH 4.5）。用PAHBAH工作試劑孵育后，溶液應(yīng)無(wú)色。
7.如果被分析的樣品含有半乳糖基蔗糖低聚糖，可以通過(guò)與黑曲霉α-半乳糖苷酶（Megazyme cat.no.E AGLANP）孵育將其去除。請(qǐng)參閱Megazyme網(wǎng)站上K-FRUC下的常見(jiàn)問(wèn)題（FAQ）。
測(cè)定程序：
將干燥樣品研磨以通過(guò)0.5毫米的篩網(wǎng)。用鋒利的刀將固體脂肪樣品（如巧克力）切成細(xì)小的刨花；軟食品（如涂抹食品）無(wú)需進(jìn)一步準(zhǔn)備即可進(jìn)行分析。所有樣品在稱(chēng)重前應(yīng)在室溫下進(jìn)行。
A.果聚糖提取
含有0-10%（w/w）果聚糖的樣品
準(zhǔn)確稱(chēng)取約400mg樣品放入干燥的pyrex螺旋蓋培養(yǎng)管（25 x 150 mm）中，并加入25 mL蒸餾水。松松地蓋住管子。將試管放入沸水浴中加熱10分鐘。5分鐘后，擰緊管帽，通過(guò)倒置和搖晃試管劇烈混合內(nèi)容物。將試管放回沸水浴中。再過(guò)5分鐘后，將試管從沸水浴中取出，通過(guò)倒置和搖動(dòng)再次混合內(nèi)容物。
含有10-40%（w/w）果聚糖的樣品
準(zhǔn)確稱(chēng)取約100mg樣品，放入干燥的pyrex螺旋蓋培養(yǎng)基中 試管（25 x 150 mm）并加入25 mL蒸餾水。松松地蓋住管子。放置 將試管放入沸水浴中加熱10分鐘。5分鐘后，擰緊 蓋上管帽，通過(guò)倒置和搖晃劇烈混合內(nèi)容物。放回試管 放入沸水浴中。再過(guò)5分鐘后，將試管從沸騰中取出 水浴，通過(guò)倒置和搖動(dòng)再次混合內(nèi)容物。在每種情況下，讓試管內(nèi)容物冷卻至室溫，然后轉(zhuǎn)移~ 2.0 mL放入2.0 mL微量離心管中，以13000 rpm離心5分鐘。
注意：對(duì)于含有40-100%（w/w）果聚糖的樣品，加入1 mL離心提取物 加入2mL水中并進(jìn)行測(cè)定。
B. 去除蔗糖、淀粉和還原糖：
- 精確分配0.2 mL待分析溶液（含 約0.1-1.0 mg/mL果聚糖）放入玻璃試管（16 x 100 mm）底部。
注意：如果樣品中蔗糖和麥芽糊精含量很高（例如嬰兒 牛奶配方），將孵化時(shí)間延長(zhǎng)至60分鐘，以確保完全 這些低聚糖的水解。 在每種情況下，讓試管內(nèi)容物冷卻至室溫，然后轉(zhuǎn)移~ 2.0 mL放入2.0 mL微量離心管中，以13000 rpm離心5分鐘。
3.向試管中加入0.2 mL試劑3（堿性硼氫化物溶液），劇烈攪拌 并用Parafilm®覆蓋管子。將試管在40°C下孵育30分鐘以達(dá)到效果 將還原糖完全還原為糖醇。
4.在試管中加入0.5mL試劑4（200mM乙酸），并在攪拌下劇烈攪拌 渦流混合器。應(yīng)觀察到強(qiáng)烈的泡騰（這種治療可以消除 過(guò)量硼氫化物并將pH值調(diào)節(jié)至約4.5）。這被稱(chēng)為解決方案S。
C.果聚糖的水解和測(cè)定：
1.準(zhǔn)確小心地將0.2 mL等分溶液S轉(zhuǎn)移到3個(gè)玻璃杯的底部 試管（16 x 100毫米）。
2.向其中2個(gè)試管中加入0.1mL果糖溶液（酶溶液B） （樣品）和0.1mL緩沖液2（100mM乙酸鈉）至第三個(gè)（樣品） 空白）。
3.將試管在40°C下孵育30分鐘，使果聚糖完全水解為D-果糖和D-葡萄糖。在培養(yǎng)過(guò)程中用Parafilm®密封試管。
4.向所有試管中加入5.0 mL PAHBAH工作試劑[樣品、樣品空白、D-果糖標(biāo)準(zhǔn)品（見(jiàn)對(duì)照和注意事項(xiàng)2.b）、試劑空白（對(duì)照和 注意事項(xiàng)2.a）和菊粉/纖維素對(duì)照提取物和/或果聚糖/ 纖維素控制]并在沸水浴中孵育6分鐘。
5.從沸水浴中取出管子，立即將其放入冷水中 將水（18-20°C）加熱約5分鐘。
6.測(cè)量所有溶液在410nm處相對(duì)于試劑空白的吸光度。 冷卻試管后盡快測(cè)量吸光度值。PAHBAH 顏色復(fù)合體會(huì)隨著時(shí)間的推移而褪色。
計(jì)算：
果聚糖（%w/w）：
其中：ΔA=樣品吸光度-樣品空白吸光度（兩者均與試劑空白相對(duì)）
F=將吸光度值轉(zhuǎn)換為μg D-果糖的系數(shù)
=（54.5μg D-果糖）/（54.5微克D-果糖的吸光度）
5=從測(cè)定的0.2 mL轉(zhuǎn)換為1.0 mL的系數(shù)
25=所用萃取劑的體積（mL）
1.1/0.2=從1.1mL酶消化液中取出0.2mL用于分析
W=提取樣品的重量（mg）（即100或200mg）
100/W=表示果聚糖占樣品重量百分比的系數(shù)
1/1000=從μg轉(zhuǎn)換為mg的系數(shù)
162/180=從游離D-果糖轉(zhuǎn)化為果糖酐（和葡萄糖酐）的因子，如
D=樣品提取物的進(jìn)一步稀釋
注意：使用Megazyme Mega-Calc™可以簡(jiǎn)化這些計(jì)算， 可從Megazyme網(wǎng)站上的產(chǎn)品顯示處下載 （www.megazyme.com）。
表1.用外加內(nèi)切菊粉酶測(cè)定各種樣品的果聚糖含量 并且不添加內(nèi)切左旋酯酶。
| 果聚糖含量，％ W/W（以干物質(zhì)為基準(zhǔn)） | ||
| 樣本 | 外消旋酶和內(nèi)消旋酶 | 外消旋和內(nèi)消旋異麥芽糖酶加內(nèi)消旋麥芽糖酶 |
| 貓尾草（樣本A） | 4.9 | 13.8 |
| 貓尾草（樣本B） | 3.2 | 6.2 |
| 黑麥草 | 8.9 | 9.9 |
| 燕麥干草 | 10.7 | 10.9 |
| 大麥MAX（谷物） | 12.8 | 12.8 |
| 來(lái)自貓尾草的純果聚糖 | 59.2 | 91.2 |
| 菊苣中的純菊粉 | 95.0 | 92.3 |
附錄：
A. 確定由于以下原因而低估果聚糖含量的程度 水解菊粉的硼氫化物還原：
- 準(zhǔn)確稱(chēng)取約40mg FOS或純果聚糖，放入干燥的派熱克斯螺帽中 培養(yǎng)管（25 x 150 mm）并加入40 mL蒸餾水。松松地蓋住管子。 在沸水浴中加熱試管10分鐘，以溶解果聚糖并攪拌 5和10分鐘后，將管內(nèi)容物放入渦流混合器中。
- 讓溶液冷卻至室溫，然后混合試管內(nèi)容物 徹底。
- 準(zhǔn)確地將0.2 mL等分溶液分配到玻璃試管底部 （16 x 100 mm）并加入0.2 mL pH 4.5的100 mm醋酸鈉緩沖液（緩沖液2）和 充分混合。
- 按照標(biāo)準(zhǔn)果聚糖程序從步驟B.3進(jìn)行到步驟C.6（包括C.6和C.6）， 第8頁(yè)），并測(cè)量不含果糖的試管的吸光度 潛伏期這給出了硼氫化物還原的果聚糖樣品的吸光度 （BRF）。
玻璃試管（16 x 120 mm），加入0.9 mL pH 4.5的100 mm醋酸鈉緩沖液（緩沖液2）在劇烈攪拌下加入試管中。
6.準(zhǔn)確小心地將0.2 mL等分溶液轉(zhuǎn)移到
三個(gè)玻璃試管（16 x 100 mm），按照以下步驟進(jìn)行果聚糖水解標(biāo)準(zhǔn)果聚糖程序；步驟C.2至C.6。這給了非硼氫化物還原的果聚糖樣品（NBRF）的吸光度。按照以下計(jì)算硼氫化物還原后標(biāo)準(zhǔn)程序中果聚糖的回收率百分比如下：
回收率=吸光度BRF/吸光度NBRF x 100
參考文獻(xiàn)：
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標(biāo)簽：
果聚糖檢測(cè)K-FRUC
- 果聚糖測(cè)定方案K-FRUC(含重組菊粉酶和左旋糖酶)使用說(shuō)明書(shū)
- 可消化和抗性淀粉檢測(cè)K-DSTRS的原理和操作步驟
- 抗性淀粉檢試劑盒K-RSTAR使用說(shuō)明書(shū)
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- β-葡聚糖(酵母和蘑菇)K-YBGL使用說(shuō)明書(shū)
- α-淀粉酶檢測(cè)試劑盒(CERALPHA METHOD)K-CERA使用說(shuō)明書(shū)
- 快速集成總膳食纖維檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)
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