葡萄糖氧化酶K-GLOX檢測試劑盒使用說明書
葡萄糖氧化酶K-GLOX
（200 次手動檢測/盒）或
（1960 次自動分析儀檢測/盒）或
（2000 次微孔板檢測/盒）
產(chǎn)品介紹：
葡萄糖氧化酶（GOX）催化β-D-葡萄糖氧化生成 D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯和過氧化氫。葡萄糖氧化酶對β-D-葡萄糖具有高度特異性，對α-D-葡萄糖完全沒有催化活性。葡萄糖氧化酶的主要用途之一是測定體液、食品和農(nóng)產(chǎn)品中的游離葡萄糖含量。它也是一種常用烘焙添加劑，用于增加面筋強(qiáng)度。在一些應(yīng)用中也可用于替代傳統(tǒng)的氧化劑，例如溴酸鹽和 L-抗壞血酸。葡萄糖氧化酶的其他用途包括去除食品包裝袋內(nèi)的氧氣和去除蛋清中的 D-葡萄糖以防止發(fā)生褐變反應(yīng)。
原理：
葡萄糖氧化酶催化 β-D-葡萄糖氧化生成 D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯，并釋放過氧化氫（H2O2）（1）。在過氧化物酶（POD）的作用下，過氧化氫與對羥基苯甲酸和 4-氨基安替比林反應(yīng)，定量生成醌亞胺染料。測定醌亞胺染料在 510 nm 波長下的吸光度值（2）。
檢測涉及的反應(yīng)如下：
試劑盒：
試劑盒：
紐勤提供可進(jìn)行 200 次手動檢測（或 1960 次自動分析儀檢測或 2000 次微孔板檢測）的試劑盒。該試劑盒包含完整的檢測方法以及：
1 號瓶：（x2）
緩沖液（12 mL，pH 7.0），含對羥基苯甲酸與防腐劑疊氮化鈉（0.09% w/v）。
置于 4 ℃下保存。有效期限請查看單獨(dú)的試劑瓶標(biāo)簽。
2 號瓶：（x2）
過氧化物酶，4-氨基安替比林和穩(wěn)定劑；凍干粉。
置于-10 ℃以下保存。有效期限請查看單獨(dú)的試劑瓶標(biāo)簽。
3 號瓶：
D-葡萄糖（約 10 g）。
D-葡萄糖（約 10 g）。
室溫密封保存。有效期限請查看單獨(dú)的試劑瓶標(biāo)簽。
4 號瓶：
葡萄糖氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品（約 2.9 U；實(shí)際酶活力值請查看試劑瓶標(biāo)簽）。
置于-10 ℃以下保存。有效期限請查看單獨(dú)的試劑瓶標(biāo)簽。
5 號瓶：
緩沖液（5 mL，pH 7.0），BSA（0.5 % w/v）和防腐劑疊氮化鈉（0.04% w/v）。
置于 4 ℃下保存。有效期限請查看單獨(dú)的試劑瓶標(biāo)簽。
試劑溶液制備：
1. 用蒸餾水將其中一個(gè) 1 號瓶內(nèi)容物稀釋至近 150 mL，得到溶液 1�，F(xiàn)配現(xiàn)用。需要時(shí)再稀釋第二個(gè) 1 號瓶的內(nèi)容物。
2. 將其中一個(gè) 2 號瓶的內(nèi)容物溶解于溶液 1 中。檢查 pH 值，如有必要，用 1 M 鹽酸（HCl）或 1 M 氫氧化鈉（NaOH）調(diào)節(jié) pH 至 7.0。定容至 200 mL，得到溶液 2（POD 混合溶液）。
在 4 ℃下可穩(wěn)定 1 個(gè)月以上，在-10 °C 以下可穩(wěn)定 12 個(gè)月以上。
如需冷凍保存，應(yīng)將試劑分裝在聚丙烯容器中保存。不可反復(fù)凍融。
3. 稱取 4.5 g 3 號瓶內(nèi)容物（D-葡萄糖），溶解于 40 mL 蒸餾水中。定容至 50 mL，得到溶液 3（D-葡萄糖）。
在-10 ℃以下可穩(wěn)定 12 個(gè)月以上。
4.& 5. 用蒸餾水將 5 號瓶內(nèi)容物稀釋至近 40 mL，得到溶液 4。用約 3 mL溶液 4 溶解 4 號瓶內(nèi)容物。將溶液定量轉(zhuǎn)移至一個(gè) 50 mL 的容量瓶中。再用約 5 mL 溶液 4 沖洗 4 號瓶，將剩余內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至容量瓶中。將剩余溶液 4 倒入容量瓶中，用蒸餾水定容至 50 mL。將溶液分裝成10 mL 小份儲存在聚丙烯容器中，得到溶液 5（葡萄糖氧化酶標(biāo)準(zhǔn)溶液）。
在-10 °C 以下可穩(wěn)定 2 年以上。
注意：
只有在懷疑檢測使用的分光光度計(jì)的準(zhǔn)確性，或者懷疑樣品中的某些物質(zhì)具有抑制作用時(shí)，才在手動檢測程序（A）中對葡萄糖氧化酶標(biāo)準(zhǔn)溶液（溶液 5）進(jìn)行測定。檢測程序 B 或 C 必須使用溶液 5。
提取/稀釋緩沖液（緩沖液 A）：
注意：
只有在懷疑檢測使用的分光光度計(jì)的準(zhǔn)確性，或者懷疑樣品中的某些物質(zhì)具有抑制作用時(shí)，才在手動檢測程序（A）中對葡萄糖氧化酶標(biāo)準(zhǔn)溶液（溶液 5）進(jìn)行測定。檢測程序 B 或 C 必須使用溶液 5。
提取/稀釋緩沖液（緩沖液 A）：
0.1 M 磷酸鉀緩沖液（pH 7.0），含 0.5 mg/mL BSA 和防腐劑 0.02%（w/v）疊氮化鈉。
向 800 mL 蒸餾水中加入 13.6 g 磷酸二氫鉀（MW=136.1），用 2 M 氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至 7.0。定容至 1 L。加入 0.5 g BSA（Sigma 貨號 A2153）和 0.2 g 疊氮化鈉（Sigma 貨號 S2002）并溶解，得到緩沖液 A。
設(shè)備（推薦）：
設(shè)備（推薦）：
1. 容量瓶（50 mL 和 100 mL）。
2. 一次性塑料比色皿（光徑 1 cm，容量 3.0 mL）。
3. 微量移液器，例如 Gilson Pipetman®（1000 μL）。
4. 正位移移液器，例如 Eppendorf Multipette®，帶 25 mL Combitip®移液管[移取0.5 mL 溶液 3（D-葡萄糖）和 2.0 mL 溶液 2（POD 混合溶液）]。
5. 分析天平。
6. 記錄式分光光度計(jì)，波長設(shè)置為 510 nm，溫度設(shè)置為 25±0.1 °C。
7. 旋渦混合器（如 IKA® Yellowline 試管振蕩器 TTS2）。
樣品制備示例：
測定酶制劑中的葡萄糖氧化酶。準(zhǔn)確稱取約 100 mg 葡萄糖氧化酶制劑置于一個(gè)100 mL 的燒杯中。加入 50.0 mL 提取/稀釋緩沖液（緩沖液 A），在磁力攪拌器上輕輕攪拌，直至完全溶解。取 1.00 mL 溶液轉(zhuǎn)移至一個(gè) 100 mL 的容量瓶中進(jìn)行稀釋，用緩沖液 A 定容至刻度線。倒置混合均勻，并根據(jù)需要進(jìn)行進(jìn)一步稀釋，以獲得適合檢測的酶濃度（0.01-0.08 U/mL）。
A.手動檢測程序：
波長：510 nm
比色皿：1 cm 光徑（玻璃或塑料材質(zhì)）
溫度：25 ± 0.1 °C
最終體積：3.0 mL
樣品溶液：葡萄糖氧化酶稀釋至 0.01-0.08 U/mL
以空氣（光路中不放置比色皿）或蒸餾水為空白
計(jì)算：
注意：可以使用 Mega-CalcTM來簡化這些計(jì)算。
測定空白和樣品的吸光度差值（A2-A1）。從樣品吸光度差值中減去空白吸光度差值，得到樣品的 20 分鐘∆A510 nm。盡管用葡萄糖氧化酶孵育后的吸光度增加值與孵育時(shí)間呈線性關(guān)系（圖 1，第 6 頁），葡萄糖氧化酶活力值（mU/檢測溶液，即/0.5 mL）與孵育 20 分鐘后在 510 nm 波長下測得的吸光度增加值的標(biāo)準(zhǔn)曲線并不具有完美的線性關(guān)系（圖 2，第 7 頁）。參照圖 2 中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出酶活力值（mU/0.5 mL），計(jì)算方法如下：
U/L 樣品溶液 = mU/0.5 mL× 2000 ×1/1000× D
= mU/0.5 mL × 2 × D
式中：
參照標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖 2，第 7 頁），得出 20 分鐘∆A510 nm 對應(yīng)的 mU/0.5 mL。
2000 =1 L 至 0.5 mL 的轉(zhuǎn)換系數(shù)
1/1000 =mU 至 U 的轉(zhuǎn)換系數(shù)
D =稀釋倍數(shù)（即，如果將樣品稀釋 10 倍，則 D=10）
對于固體和半固體樣品，在樣品制備過程中稱量其質(zhì)量，并按以下公式計(jì)算稱重樣品的酶活力（U/g）：
葡萄糖氧化酶活力（U/g 制劑）
= GOX 活力 [U/L 樣品溶液]/質(zhì)量樣品[g/L 樣品溶液]
圖 1：檢測混合物中不同葡萄糖氧化酶濃度的反應(yīng)曲線的線性關(guān)系。A. 0 mU；B. 10 mU；C. 20 mU；D. 30 mU；E. 40 mU。
mUnits/0.5 mL=（15.4 × Abs2）+（44.7 × Abs）+0.03
圖 2：葡萄糖氧化酶活力（mU/檢測溶液，即/0.5 mL）與 510 nm 波長下吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
B.自動分析儀檢測程序：
注意：
1. 葡萄糖氧化酶自動分析儀檢測程序可使用單點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)法或完整校準(zhǔn)曲線進(jìn)行。
2. 對于用于葡萄糖氧化酶測定的每批樣品，必須使用同一批試劑進(jìn)行單點(diǎn)校正
或繪制校準(zhǔn)曲線。
試劑制備步驟如下：
制備 R1：
方法示例：
R1：0.250 mL
樣品：0.050 mL
反應(yīng)時(shí)間：25 ℃下反應(yīng) 20 分鐘
波長：510 nm
制備試劑的穩(wěn)定性：冷藏可穩(wěn)定 2 天以上
計(jì)算：動力學(xué)計(jì)算
反應(yīng)方向：增加
線性度：0.01-0.08 U/mL 葡萄糖氧化酶，樣品體積為 0.01 mL
C.微孔板檢測程序：
注意：
1. 葡萄糖氧化酶微孔板檢測程序可使用單點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)法或完整校準(zhǔn)曲線進(jìn)行。
2. 對于用于葡萄糖氧化酶測定的每批樣品，必須使用同一批試劑進(jìn)行單點(diǎn)校正或繪制校準(zhǔn)曲線。
波長：510 nm
微孔板：96 孔（透明平底，玻璃或塑料材質(zhì)）
溫度：25 °C
最終體積：0.300 mL
線性度：每孔 0.01-0.08 U/mL 葡萄糖氧化酶（樣品體積為 0.05 mL）
計(jì)算（微孔板檢測程序）：
測定空白樣、樣品和校準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)品（或單點(diǎn)法標(biāo)準(zhǔn)品）的吸光度差值（A2-A1）。從樣品和標(biāo)準(zhǔn)品吸光度差值中減去空白樣吸光度差值，得到 20 分鐘∆A510 nm。直接交叉參照 20 分鐘∆A510 nm 與葡萄糖氧化酶活力校準(zhǔn)曲線，得到檢樣的葡萄糖氧化酶活力值。
或者：
如果在樣品制備過程中對樣品進(jìn)行稀釋處理，則必須將結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，D。
標(biāo)簽：
葡萄糖氧化酶K-GLOX
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