脂質(zhì)體2000使用說(shuō)明書及產(chǎn)品特點(diǎn)

注意事項(xiàng) 

推薦在混合前使用Opti-MEM I低血清培養(yǎng)基(Cat. No. 31985-062)稀釋 Lipofectamine 2000和核酸。 

轉(zhuǎn)染過(guò)程中勿向培養(yǎng)基中添加抗生素，以免造成細(xì)胞死亡。 

不同批實(shí)驗(yàn)請(qǐng)保持細(xì)胞接種條件相同。 

請(qǐng)檢測(cè)無(wú)血清培養(yǎng)基與Lipofectamine 2000的兼容性，因?yàn)橐恍�無(wú)血清培養(yǎng) 基(如CD293, SFM II, VP-SFM等)可能抑制陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。

脂質(zhì)體RNAi或siRNA轉(zhuǎn)染

下列步驟適用于24孔板培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，至于其他培養(yǎng)材料，請(qǐng)參考轉(zhuǎn)染規(guī)模調(diào)整，所有數(shù)量和體積均是按每孔計(jì)算。

1. 轉(zhuǎn)染前一日，將細(xì)胞接種于500 μl不含抗生素的培養(yǎng)基中，使其在轉(zhuǎn)染時(shí)長(zhǎng) 至30-50%融合。

2. 轉(zhuǎn)染液制備，每孔細(xì)胞用量如下：

A. 用50 μl Opti-ME I低血清培養(yǎng)基(或者其他無(wú)血清培養(yǎng)基)稀釋20 pmol siRNA(轉(zhuǎn)染時(shí)siRNA終濃度為33 nM)，輕輕混勻。

B. 使用前輕輕搖勻Lipofectamine 2000，然后取1 μl Lipofectamine 2000在 50 μl Opti-ME I培養(yǎng)基中稀釋，室溫孵育5分鐘。注意：請(qǐng)?jiān)?5分鐘內(nèi)進(jìn)行下一步操作

C. 將前兩步所稀釋的DNA和Lipofectamine 2000混合(使總體積為100 μl)， 輕輕混勻，室溫放置20分鐘(溶液可出現(xiàn)渾濁)。

3. 在每孔細(xì)胞中加入100 μl轉(zhuǎn)染液，輕輕搖勻。 37℃培養(yǎng)24-96小時(shí)后檢測(cè)基因表達(dá)，轉(zhuǎn)染4-6小時(shí)后可更換培養(yǎng)基。

脂質(zhì)體siRNA轉(zhuǎn)染優(yōu)化

可調(diào)整siRNA與Lipofectamine 2000的用量以優(yōu)化轉(zhuǎn)染，在24孔板，siRNA可在10-50 pmol之間調(diào)整，Lipofectamine 2000可在0.5-1.5 μl之間調(diào)整，在增加細(xì)胞密度時(shí)也應(yīng)優(yōu)化轉(zhuǎn)染劑量。更多RNAi轉(zhuǎn)染技巧可參考《成功RNAi七步法》

脂質(zhì)體DNA轉(zhuǎn)染

下列步驟適用于24孔板培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，至于其他培養(yǎng)材料，請(qǐng)參考轉(zhuǎn)染規(guī)模調(diào)整，所有數(shù)量和體積均是按孔計(jì)算。大部分細(xì)胞系所使用的DNA(μg)與Lipofectamin 2000(μl)的比值為1:2到1:3，轉(zhuǎn)染高密度細(xì)胞可獲得高轉(zhuǎn)染效率、高表達(dá)水平和低細(xì)胞毒性。優(yōu)化轉(zhuǎn)染是必需的(見優(yōu)化脂粒DNA轉(zhuǎn)染)。

1. 貼壁細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天每孔0.5-2×105個(gè)細(xì)胞接種于500 μl不含抗生素的培 養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞可長(zhǎng)至90-95%融合。 懸浮細(xì)胞：在配制轉(zhuǎn)染液前每孔4-8×105個(gè)細(xì)胞接種于500 μl不含抗生素的培養(yǎng)基中。

2. 轉(zhuǎn)染液制備，每孔細(xì)胞用量如下：

A. 用50μl Opti-ME I低血清培養(yǎng)基(或者其他無(wú)血清培養(yǎng)基)稀釋質(zhì)粒DNA，輕輕混勻。 B. 使用前輕輕搖勻Lipofectamine 2000，然后取適量Lipofectamine 2000在50 μl Opti-ME I培養(yǎng)基中稀釋，室溫孵育5分鐘。注意：請(qǐng)?jiān)?5分鐘內(nèi)進(jìn)行下一步操作。

C. 將前兩步所稀釋的DNA和Lipofectamine 2000混合(使總體積為100μl)，輕輕混勻，室溫放置20分鐘(溶液可出現(xiàn)渾濁)。注意：轉(zhuǎn)染復(fù)合物常溫下可在6小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定。

3. 在每孔細(xì)胞中加入100 μl轉(zhuǎn)染液，輕輕搖勻。

4. 37℃培養(yǎng)18-48小時(shí)后檢測(cè)基因表達(dá)，轉(zhuǎn)染4-6小時(shí)后可更換培養(yǎng)基。

5. 對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后以1:10稀釋接種于新鮮培養(yǎng)基中，第二天可加入選擇培養(yǎng)基。

優(yōu)化脂質(zhì)體DNA轉(zhuǎn)染

可通過(guò)改變細(xì)胞密度、質(zhì)粒DNA密度和Lipofectamine 2000濃度以優(yōu)化轉(zhuǎn)染。要保證細(xì)胞融合在90%以上，DNA (μg): Lipofectamin 2000 (μl)可在1:0.5到1:5之間進(jìn)行調(diào)整。

轉(zhuǎn)染規(guī)模調(diào)整

不同培養(yǎng)材料轉(zhuǎn)染液、細(xì)胞和培養(yǎng)基的用量按照培養(yǎng)材料面積換算。在96孔板細(xì)胞高通量自動(dòng)分析系統(tǒng)，推薦每孔使用50 μl轉(zhuǎn)染液。注意：在96孔板，可將細(xì)胞直接接種于轉(zhuǎn)染液中以實(shí)現(xiàn)快速轉(zhuǎn)染，直接在培養(yǎng)板中配制轉(zhuǎn)染液100μl，直接將細(xì)胞加入培養(yǎng)板中，其密度為上述方法的2倍，細(xì)胞在轉(zhuǎn)染液中可正常貼壁。

產(chǎn)品特點(diǎn):

Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞具有以下優(yōu)點(diǎn)： 

對(duì)多種細(xì)胞和培養(yǎng)器皿具有很高的轉(zhuǎn)染效率，成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系

核酸-Lipofectamine 2000復(fù)合物(轉(zhuǎn)染液)可直接加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，不管 培養(yǎng)基是否含有血清。 

轉(zhuǎn)染后不必去除轉(zhuǎn)染液，或者改變或添加培養(yǎng)基，但轉(zhuǎn)染4-6小時(shí)后可去除 轉(zhuǎn)染液