細(xì)胞培養(yǎng)的注意事項(xiàng)

養(yǎng)好細(xì)胞注意點(diǎn)

（一）冷凍管應(yīng)如何解凍 

取出冷凍管后，須立即放入37 ℃ 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)，必須注意安全，預(yù)防冷凍管的爆裂。

（二）細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，DMSO如何處理

在細(xì)胞解凍之后，可直接離心去除DMSO，用新鮮的培養(yǎng)基懸浮后直接放入含有 新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，如此可避免解凍后細(xì)胞生長(zhǎng)受到DMSO影響。

（三）可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基

每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無(wú)法立即適應(yīng)，造成細(xì)胞無(wú)法存活，不應(yīng)該馬上替換。

（四）可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清種類(lèi)

 血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，所以血清的種類(lèi)和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來(lái)自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無(wú)法存活。

（五）何謂 FBS，F(xiàn)CS，CS，HS

FBS （fetal bovine serum） 和 FCS （fetal calf serum） 是相同的意思，兩者都是指胎牛血清。CS （calf serum） 則是指小牛血清。HS （horseserum） 則是指馬血清。

（六）培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用 5% 或 10% CO₂

一般培養(yǎng)基中大都使用 HCO₃^-/CO₃^2-/H⁺ 作為 pH 的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中 NaHCO₃ 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的 CO₂ 濃度。理論當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO₃ 含量為每公升 3.7 g 時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用 10% CO₂；當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO₃ 為每公升 1.5 g 時(shí)，則應(yīng)使用 5% CO₂ 培養(yǎng)細(xì)胞。

（七）何時(shí)須更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中是否須添加抗生素。

視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。

一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中可以添加抗生素。 按1％體積分?jǐn)?shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U／mL和100 μ／mL。

(八）貼壁細(xì)胞傳代時(shí)所使用的 trypsin-EDTA 濃度及相應(yīng)處理

一般使用的 trypsin-EDTA 濃度為 0.25% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中，保存于 –20 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成 trypsin 的活性降低，并可減少污染的機(jī)會(huì).。

（九）將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái)，離心速率多少

回收動(dòng)物細(xì)胞，其離心速率一般為 1 000 rpm，5~10 分鐘，過(guò)高的轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。

（十）細(xì)胞的接種密度

依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤(pán)的比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)的重要原因之一。

（十一）細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基的成分及DMSO的等級(jí)

動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含 5~10% DMSO （dimethyl sulfoxide） 和 90~95 % 原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合。注意：由于 DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能，故不可將 DMSO 直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。冷凍保存使用的 DMSO 等級(jí)，必須為 Tissue culture grade 的 DMSO ，其本身即為無(wú)菌狀況，第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中避光保存。

（十二）冷凍保存細(xì)胞的方法及冷凍細(xì)胞濃度

將貼壁細(xì)胞消化后離心收集，懸浮細(xì)胞直接離心收集，以含有DMSO完全培養(yǎng)基或胎牛血清的凍存液重懸細(xì)胞至終濃度約1x10⁶/ml。。以每管1～2ml分裝至凍存管中。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍過(guò)夜。次日保存到液氮中。 

冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為 1x10⁶ cells/ml vial，融合瘤細(xì)胞則以 5x10⁶ cells/ml vial 為宜。