P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)試劑盒產(chǎn)品說明書

 P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)試劑是一種旨在通過供體大腸桿菌制備具有部分細菌基因的噬菌體，感染特定受體大腸桿菌，獲得細菌之間基因片段的轉(zhuǎn)移，而獲得遺傳重組的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于通用型非特異性基因片段的轉(zhuǎn)導(dǎo)。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，性能穩(wěn)定，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高。

技術(shù)背景

噬菌體（bacteriophage或phage）是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物，并使其細胞裂解死亡的病毒，本世紀初在葡萄球菌和志賀菌中首先發(fā)現(xiàn)。噬菌體具有病毒的一些特性：個體微小，可以通過濾菌器；沒有完整的細胞結(jié)構(gòu)，主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成的衣殼和包含于其中的核酸組成；只能在活的微生物細胞內(nèi)復(fù)制增殖，是一種專性細胞內(nèi)寄生的微生物。在含細菌的固體培養(yǎng)基上，噬菌體使細菌細胞裂解而形成的空斑，稱為噬菌斑。每個空斑都是由一個噬菌體顆粒一再侵染、增殖、裂解所形成的，故可用于進行噬菌體的計數(shù)。由于噬菌體結(jié)構(gòu)簡單、基因數(shù)少，容易獲得大量的突變體，因此是研究核酸以及核酸與蛋白質(zhì)相互作用的重要工具，是分子生物學(xué)與基因工程的良好實驗系統(tǒng)。P1噬菌體是一種針對大腸桿菌的通用型轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體，既可以包裝（packaging），又能轉(zhuǎn)導(dǎo)，成為微生物基因組非特異性基因片段（長達100kb）操作的標準化模型工具。 

產(chǎn)品內(nèi)容

專養(yǎng)液（Reagent A） 毫升

溶解液（Reagent B）      毫升

普養(yǎng)液（Reagent C） 毫升

轉(zhuǎn)導(dǎo)液（Reagent D） 毫升

強化液（Reagent E） 毫升

產(chǎn)品說明書         1份

保存方式

保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

P1噬菌體：用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的噬菌體

供體/受體宿主細菌：用于噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)的目標

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

9cm直徑細菌培養(yǎng)皿：用于受體細菌選擇培養(yǎng)的容器

培養(yǎng)箱：用于細菌培養(yǎng)

恒溫搖床：用于宿主細菌培養(yǎng)

微型臺式離心機：用于樣品操作

實驗步驟

一、P1噬菌體制備

• 移取xx毫升專養(yǎng)液（Reagent A）到15毫升錐形離心管
• 加入50微升用戶自備的過夜新鮮培養(yǎng)的供體宿主細菌（10⁸ 細菌/毫升）
• 放進37℃恒溫搖床孵育45分鐘，速度為220RPM
• 加入100微升用戶自備的P1噬菌體（5 X 10⁹ PFU/毫升），混勻
• 放進37℃恒溫搖床孵育3小時或直至細菌完全溶解，速度為220RPM（注意：光線下未見漂浮的顆粒碎片）
• 加入xx微升溶解液（Reagent B），混勻
• 放進37℃恒溫搖床孵育5分鐘，速度為220RPM
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為9200g
• 移取4毫升上清液到新的15毫升錐形離心管
• 放進4℃冰箱里保存或置于冰槽里備用

二、噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)

• 移取xx毫升普養(yǎng)液（Reagent C）到15毫升錐形離心管
• 加入5微升用戶自備的受體宿主細菌（10⁸ 細菌/毫升）
• 放進37℃恒溫搖床孵育過夜，速度為220RPM
• 移取1.5毫升菌液到新的1.5毫升離心管
• 放進微型臺式離心機離心2分鐘，速度為16000g
• 小心去掉上清液
• 加入xx微升轉(zhuǎn)導(dǎo)液（Reagent D），混勻顆粒群
• 準備好4個1.5毫升離心管，標記為1至4號管
• 分別加入100微升上述制備的受體宿主細菌到每個離心管
• 移取xx微升上述制備的P1噬菌體到1號管，混勻
• 移取xx微升上述制備的P1噬菌體到2號管，混勻
• 移取xx微升上述制備的P1噬菌體到3號管，混勻

• 室溫下孵育30分鐘
• 分別加入xx毫升強化液（Reagent E），混勻
• 放進37℃恒溫搖床孵育1小時，速度為220RPM
• 放進微型臺式離心機離心2分鐘，速度為16000g
• 小心去掉上清液
• 加入xx微升普養(yǎng)液（Reagent C），混勻顆粒群
• 鋪板在用戶自備的90mm直徑的瓊脂糖選擇細菌培養(yǎng)基上（注意：含有抗生素等選擇培養(yǎng)基）
• 倒置細菌培養(yǎng)皿
• 放進37℃培養(yǎng)箱孵育16小時
• 觀察和計數(shù)——對照組無菌落生長；P1噬菌體量越多，轉(zhuǎn)導(dǎo)體細菌菌落越多
• 挑選1個獨立的菌落
• 在用戶自備的90mm直徑的瓊脂糖選擇細菌培養(yǎng)基上劃線分離
• 倒置細菌培養(yǎng)皿
• 放進37℃培養(yǎng)箱孵育16小時
• 重復(fù)實驗步驟23至26一次
• 后續(xù)鑒定陽性轉(zhuǎn)導(dǎo)體菌落：PCR擴增或測序

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 整個操作須無菌操作
• 使用時，切莫污染母液
• 通常使用P1virW3110噬菌體為佳
• 通常的宿主細菌含有遺傳標記，便于篩選
• 本產(chǎn)品可以獲得100至1000轉(zhuǎn)導(dǎo)體菌落/毫升PI噬菌體
• 如果需要徹底去除殘余菌體，獲得不含宿主細菌的噬菌體原液，可以使用0.45微米孔徑的過濾器過濾
• P1噬菌體制備后的效價鑒定，建議使用 P1噬菌體效價檢測試劑盒——60091
• 選擇培養(yǎng)基的抗生素參考劑量如下

• 本公司提供系列噬菌體實驗產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無細菌污染
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定繁殖效價高