病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒

一、簡(jiǎn)介

病毒總核酸提取試劑盒適合于從血清、血漿、組織勻漿等樣品中提取病毒總核酸。試劑盒基于硅膠柱純化技術(shù)，提取過(guò)程中無(wú)需使用有毒的酚氯仿抽提，也無(wú)需進(jìn)行耗時(shí)的醇類沉淀。該產(chǎn)品已經(jīng)成功地提取了乙肝A/C、丙肝、以及諾如病毒標(biāo)準(zhǔn)品等的核酸。獲得的DNA/RNA可直接用于PCR、RT-PCR、以及LAMP等系列下游實(shí)驗(yàn)。

二、組成

注意：

1. Carrier RNA 固體使用前必須用 Nuclease Free Water 溶解至 1µg/µl，渦旋溶解。分裝保存-70℃。如需長(zhǎng)期保存于-20℃，請(qǐng)先按照使用次數(shù)分裝后保存。

2. 溶解Proteinase K（20mg/ml）：加入Protease Dissolve Buffer溶解Proteinase K至終濃度為 20mg/ml。Proteinase K干粉在2-8℃保存一年，但溶解的 Proteinase K 須分裝保存于-20℃。 反復(fù)凍融 Proteinase K 會(huì)影響其活性。

3. Buffer VHB 使用前必須用14 ml無(wú)水乙醇稀釋，并于室溫保存。

4. Buffer RW2 使用前必須用80 ml無(wú)水乙醇稀釋，并于室溫保存。

三、保質(zhì)期

本產(chǎn)品除Proteinase K和Carrier RNA外，其它組份可在室溫(15-25℃)保存12個(gè)月，長(zhǎng)期保存時(shí)需置于2-8℃。Proteinase K 和 Carrier RNA 干粉室溫運(yùn)輸，收到試產(chǎn)品后請(qǐng)保存于-20℃，溶解后分裝保存于-20℃。

四、需要準(zhǔn)備的材料和工具

• Buffer PBS
• 無(wú)水乙醇
• 潔凈的鑷子和剪刀
• 微量移液器（100-1000μl，10-100μl）
• 無(wú)RNA酶的離心管和吸頭
• 渦旋振蕩器
• 離心機(jī)（轉(zhuǎn)速≥10,000 rpm）

五、實(shí)驗(yàn)步驟

• 轉(zhuǎn)移20 µl Proteinase K 至1.5 ml離心管中。
• 轉(zhuǎn)移200 µl樣品，如血清、血漿、尿液、 培養(yǎng)液上清、或其它無(wú)細(xì)胞體液至裝有 Proteinase K 的離心管中，振蕩混勻5秒。若樣品不足200 µl，用Buffer PBS或Nuclease Free Water 補(bǔ)足。

（固體組織樣品先用 Buffer PBS浸泡或勻漿后，離心取上清進(jìn)行操作；干粉樣品請(qǐng)先用Buffer PBS充分溶解后離心取上清進(jìn)行操作。）

• 轉(zhuǎn)移200 µl Buffer AL/Carrier RNA至樣品中，渦旋混勻15秒。

使用前，按每1 ml Buffer AL加入15 µl Carrier RNA（1 µg/µl）。該混合液室溫可保存2天。

• 56ºC水浴10分鐘。
• 加入250µl 無(wú)水乙醇至裂解液中，渦旋混勻 15 秒。室溫靜置 3 分鐘。
• 把核酸吸附柱裝在2ml 收集管中。轉(zhuǎn)移混合液至柱子中。8,000 g離心 30-60秒。
• 倒棄濾液把柱子裝回收集管中。加入500 µl Buffer VHB（已用無(wú)水乙醇稀釋）至柱子中。8,000 g離心30-60秒。

使用前 Buffer VHB 必須按瓶子標(biāo)簽所示用無(wú)水乙醇稀釋。

• 倒棄濾液把柱子裝回收集管中。加入500 µl Buffer RW2（已用無(wú)水乙醇稀釋）至柱子中。8,000 g 離心30-60秒。

使用前 Buffer RW2 必須按瓶子標(biāo)簽所示用無(wú)水乙醇稀釋。

• 倒棄濾液把柱子裝回收集管。加入500 µl Buffer RW2（已用無(wú)水乙醇稀釋）至柱子中。8,000 g離心30-60秒。
• 倒棄濾液把柱子套回收集管。10,000 rpm 離心空柱3分鐘甩干柱子。
• 將柱子轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管。加入15~30 µl Nuclease Free Water至柱子的膜中央。13,000 g離心1分鐘。
• 棄去柱子，把DNA/RNA 保存于-80ºC。

六、常見(jiàn)問(wèn)題解答

1. 柱子堵塞

• 樣品用量太多：處理動(dòng)物抗凝血液時(shí)，樣品量控制在100~150 µl。盡量使用無(wú)細(xì)胞的樣品，如血漿、血清、組織勻漿液的上清等。
• Proteinase K活性下降：重新制備Proteinase K。使用后Proteinase K必須保存于-20℃。Proteinase K與 Buffer AL不能預(yù)先混合。
• 樣品含固體顆粒：在第5步加入乙醇前，10,000 g離心3分鐘去除未消化的雜質(zhì)，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管后再加入乙醇。
• 樣品裂解不充分：樣品與Buffer AL混勻不充分。重新提取，加入Buffer AL后先顛倒混勻3~5次，然后以最高速度渦旋讓樣品與Buffer AL充分混勻。

2. 下游應(yīng)用結(jié)果不理想

• 樣品被反復(fù)解凍：避免反復(fù)凍融樣品。推薦使用新鮮樣品或只解凍過(guò)一次的樣品。
• Nuclease Free Water 被污染：更換新的 Nuclease Free Water或DEPC處理水。
• 試劑準(zhǔn)備有誤：按瓶子標(biāo)簽所示，加入合適體積的無(wú)水乙醇至 Buffer VHB 和Buffer RW2 中。
• Proteinase K活性下降：重新制備Proteinase K。使用后Proteinase K 必須立即保存于-20℃。分裝保存 Proteinase K，避免反復(fù)凍融。
• 乙醇?xì)埩簦?/STRONG>柱子在洗脫前，需要空甩去除乙醇。對(duì)于敏感的應(yīng)用，柱子在洗脫后，打開(kāi)柱子的蓋子，放置 10~15 分鐘讓乙醇徹底揮發(fā)。
• 洗脫效率：處理富含 DNA 的樣品時(shí)，把 Nuclease Free Water預(yù)熱至55℃后再進(jìn)行洗脫，有利于提高DNA得率。
•