相干拉曼散射顯微術詳解 Ⅱ

“ 上節(jié)我們講到——相干拉曼散射（CRS）顯微術是一種基于分子化學鍵振動的成像手段。相比于熒光光譜，拉曼光譜具有窄得多的譜峰寬度（圖 1），可以選擇探測的分子種類將更多，特異性也更高。例如，生物組織中的蛋白、脂質和核酸等具有各自的拉曼光譜特征，利用 CRS 可以在無需染色/標記的前提下對它們進行區(qū)分成像。
”

但脫離應用的理論就像浩渺星海中失去坐標的飛船，空得一身高強本領卻無處發(fā)揮。因此，秉承上節(jié)所述的相干拉曼顯微術的基本原理，本小節(jié)將圍繞快速病理檢測、生物代謝和藥物運輸三個典型方面詳細展開免標記相干拉曼顯微術的應用，為這艘“神州飛船”的前行指引明燈。

▲圖 1. 常見生物組分和分子的拉曼光譜

快速病理檢測：

病理檢測是疾病診斷的金標準。現(xiàn)有的病理檢測方法需要經過活檢（或手術）取樣、固定、切片、染色等一系列繁雜過程，往往耗時幾天，無法實現(xiàn)術中實時診斷。術中冰凍往往也至少需要半個小時，而且診斷準確率不高。基于生物組織內源性光學信號的成像方法有望快速提供組織病理學信息，輔助術中診斷。

2013 年，季敏標教授在哈佛大學謝曉亮教授課題組學習期間利用 SRS 顯微鏡實現(xiàn)了在腦膠質瘤小鼠模型活體中原位實時地探測腫瘤邊界^[1]，之后在離體人腦腫瘤手術標本中實現(xiàn)無標記病理診斷^[2]。歸國后，季教授課題組在復旦大學搭建了結合了 SRS、SHG 和 TPEF 的多模態(tài)非線性光學成像系統(tǒng)，可同時獲取脂質、蛋白、膠原纖維三個通道的圖像。在近期一篇文章中，季教授不僅在喉癌組織切片層面展示了 SRS 和傳統(tǒng)病理 HE 染色的高度一致性（圖 2），并且通過對喉癌術中新鮮組織的成像，累計了數(shù)萬份圖像數(shù)據(jù)，最后基于搭建的 34 層殘差卷積神經網(wǎng)絡（ResNet34）進行圖像訓練識別，獲得了近乎 100%準確率的腫瘤與正常組織的鑒別效果^[3] 。

由于 SRS 繼承了自發(fā)拉曼的光譜特性，使其能夠在高光譜掃描時得到重要的譜學信息。在對阿爾茲海默（AD）研究的過程中^[4] ，發(fā)現(xiàn)錯誤折疊的淀粉樣蛋白會因為 β-sheet 的富集而導致 amide I 的拉曼峰藍移（峰位從 1658 cm^-1變?yōu)?1670 cm^-1）；并且通過對新鮮 AD 鼠腦組織成像，觀察到了每個 Aβ 斑塊的周圍都會有一圈“Halo”的特殊構象（圖 3），這是熒光研究（只能對確定物質進行特異性染色）所難以發(fā)現(xiàn)的，充分體現(xiàn)了 SRS 在病理學檢測上的獨特優(yōu)勢。

▲圖 2. SRS 與 HE 圖像的一致性對比（綠：脂質；藍：蛋白質；紅：膠原纖維）[3]

▲圖 3. 新鮮 AD 鼠腦的 SRS 光譜圖像以及斑塊、正常組織的光譜差異 [4]。（a-c）指紋區(qū)的光譜圖像，綠：脂質；藍：正常蛋白質；洋紅：淀粉樣蛋白斑塊。（d-f）C-H 伸縮振動區(qū)的光譜圖像，綠：脂質；洋紅：總蛋白質。(g-h)不同組織區(qū)域的 SRS 光譜

生物代謝：

以高時空分辨率直接觀察活體動物的代謝動力學對理解許多生物學過程至關重要。脂類分子是重要的生命組成物質，但定量地觀察其空間分布一直是一個難題。使用熒光基團時，有可能產生假象，做出的判斷有偏差。相比之下，SRS 可以對分子直接可視化，得到的結果具有普遍意義。

2018 年，哥倫比亞大學閔瑋教授課題組發(fā)展了將重水（D2O）代謝與受激拉曼散射（DO-SRS）顯微技術相結合的技術，用于原位代謝觀測^[5] 。在生物代謝過程中，經過酶的催化合成，D2O 中的氘原子會被自動整合到有機分子中，形成同位素標記的 C-D 鍵。因此，基于對新合成有機分子中 C-D 鍵的成像，就可以實現(xiàn)生物代謝的追蹤觀測（視頻 1）。目前，在 C-D 鍵的廣泛振動光譜中，他們發(fā)現(xiàn)了脂質和蛋白質的特異性拉曼位移，并開發(fā)了光譜解調方法來獲得具有大分子選擇性的 C-D 信號，做到了在動物模型中脂質、蛋白甚至糖類的代謝測量^[6][7]。 

藥物運輸：

在醫(yī)藥學中，藥物的運輸是學者們關注的重點之一，準確地運輸過程及定位，是藥物分子能實現(xiàn)特定生理功能的重要保障。制作小分子藥物的熒光標簽并非容易之事，常用的熒光標簽往往比藥物分子大很多，這會影響他們的運輸特性；因此，利用傳統(tǒng)熒光標記方法追蹤小分子藥物面臨很多挑戰(zhàn)。而很多藥物分子本身具有特殊的化學鍵振動（圖 4），因此，利用 SRS 可以對該藥物進行很好的特異性成像，加之 SRS 不需要對樣品固定、染色等操作，最大程度上保持了生物體樣品的活性，可以實現(xiàn)系列活體動態(tài)捕捉。

2014 年，閔瑋教授將療霉舒乳膏涂抹于小鼠耳朵部位，通過對藥膏中鹽酸特比萘芬分子的炔基進行特異性成像，結合脂質和蛋白通道的共定位，發(fā)現(xiàn)了該藥物是通過皮膚中脂質進行滲透的^[8]（圖 5）。

同年，謝曉亮教授課題組報道了利用高光譜受激拉曼散射（hsSRS）成像技術對兩種酪氨酸激酶抑制劑（TKI）藥物（伊馬替尼和尼洛替尼）在活細胞內的免標記成像以及定量分析^[9] 。他們發(fā)現(xiàn)，由于這兩種藥物具有溶酶體的親溶性，它們在溶酶體中的濃度都增加了 1000 倍以上。當同時使用氯喹時，伊馬替尼的溶酶體捕獲減少了十倍以上，這表明氯喹除了常見的自噬抑制機制外，還可能通過溶酶體介導的藥物相互作用提高 TKIs 的療效。

▲圖 4. 藥物分子的結構式及其拉曼光譜 [9]

▲圖 5.局部應用鹽酸特比萘芬對小鼠耳部皮膚的 SRS 成像（2230cm^-1：鹽酸特比萘芬；1655cm^-1：蛋白質；脂質 2845cm^-1：脂質）[8]

下一節(jié)我們還將聚焦 CRS 發(fā)展前沿，介紹 CRS 技術的最新進展。

作者簡介

季敏標，男，1982 年出生于浙江省臺州市。2001 年獲北京大學物理系學士；2011 年獲美國斯坦福大學物理系博士學位，研究方向為非線性光學和超快分子動力學；之后在哈佛大學謝曉亮組里從事博士后研究（2011-2014），發(fā)展相干拉曼成像技術并將其應用到腫瘤的無標記探測。2014 年入職復旦大學物理系擔任研究員和博士生導師。2015 年入選中組部“千人計劃”（青年組）和上海市“青年科技啟明星計劃”。

季教授的研究方向集中在非線性光譜學在物理、化學和生物醫(yī)學等交叉學科中的應用，研究課題包括利用新型光譜顯微成像技術研究生物醫(yī)學問題，以及新材料的光電子特性研究等。迄今發(fā)表 SCI 論文 50 余篇，包括 Science, Science Translational Medicine, Science Advances, PNAS 等。并承擔科技部重點研發(fā)計劃“數(shù)字診療裝備”青年專項、基金委面上項目、上海市科技創(chuàng)新行動計劃等多項科研項目。