新型冠狀病毒病原學(xué)檢測(cè)假陰性的產(chǎn)生原因及高效檢測(cè)方法分析

自2020年開始，新型冠狀病毒肺炎的疫情就一直牽動(dòng)著億萬人的心。截至2月11日8:29，全國(guó)已確診病例累計(jì)42708例，疑似21675例，疫情防控形勢(shì)依然嚴(yán)峻。

 

新型冠狀病毒傳播方式多樣，除了經(jīng)呼吸道飛沫和接觸傳播的主要途徑外，目前已有報(bào)道病毒還可以經(jīng)由氣溶膠、消化道、母嬰等不同方式傳播，傳播渠道多，傳染力強(qiáng)。因此，控制nCov病毒傳播比SARS等以往冠狀病毒傳播更加困難，也是目前感染率居高不下的重要原因之一，早發(fā)現(xiàn)，早隔離，早確診，早治療是本次疫情防控的重中之重。

 

根據(jù)國(guó)家發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（第五版）》，“疑似”和“確診”的含義是：

 

 

由此可見，除了及早發(fā)現(xiàn)臨床表現(xiàn)異常之外，及早從病原學(xué)確診更是疫情防控的重要一環(huán)�？焖俅_診不但可以盡早對(duì)病人施以對(duì)癥的治療方法和藥物、增加病人存活率，更可以減少醫(yī)療物資的使用量，提高醫(yī)療效率，更有力的控制疫情。

 

對(duì)于病原學(xué)檢測(cè)，雖然有研究表明CRISPR和免疫方法也可用于病毒檢測(cè)，但熒光RT-PCR和基因測(cè)序目前仍是唯二被認(rèn)可的方法。兩者相比，前者無疑有更大的優(yōu)勢(shì)，通常在1小時(shí)內(nèi)即可檢測(cè)接近幾十甚至幾百個(gè)核酸樣本。所以，當(dāng)前諸多醫(yī)院和醫(yī)檢所均采用RT-qPCR的方法，使用官方公布的引物和探針，檢測(cè)nCov的N1，N2，N3三個(gè)靶標(biāo)基因檢測(cè)和人類RNase P，通過陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和目的基因的Ct值判斷標(biāo)本中是否含有nCov病毒（Real-Time RT-PCR Panel for Detection 2019-Novel Coronavirus, www.cdc.gov）。

 

另一方面，確診除了需要速度，更需要精度，要在最大程度避免假陰性的產(chǎn)生。假陰性不但會(huì)造成對(duì)個(gè)體的錯(cuò)誤判斷，延誤病情，更有可能造成傳染源的遺漏，造成更大規(guī)模的傳染。假陰性的產(chǎn)生原因主要有以下幾點(diǎn)：

1. 樣本采集不當(dāng)，并未采集到合理位置的標(biāo)本，病毒含量不能反映真實(shí)狀況。

2. 樣本保存和處理不當(dāng)，造成處理過程中病毒RNA降解。

3. 提取效率低，病毒并未完全提取，或提取過程中病毒降解。

4. 檢測(cè)分辨率低，檢測(cè)下限過高，導(dǎo)致無法檢出病毒。

5. 實(shí)驗(yàn)員操作不當(dāng)。

由此可見，無論是RT-qPCR檢測(cè)步驟，還是檢測(cè)之前的病毒核酸提取的步驟，都要最大程度的避免產(chǎn)生假陰性。

 

標(biāo)準(zhǔn)的樣本類型，規(guī)范的樣本采集、處理和運(yùn)輸，是避免假陰性的第一步。雖然已有報(bào)道病毒會(huì)通過糞口等其他方式傳播，但目前世界衛(wèi)生組織（WHO）的最新資料表明，呼吸材料（鼻咽和口拭子、痰液、肺泡灌洗液等）和血清樣本是檢測(cè)nCov的標(biāo)準(zhǔn)。WHO給出的臨時(shí)指導(dǎo)中，樣本類型、采集和儲(chǔ)運(yùn)的方式如下（Laboratory testing for 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) in suspected human cases）：

 

 

在核酸提取層面，避免假陰性最重要的就是要提高核酸的得率。提高得率的難點(diǎn)有三：1. 上述樣本不屬于培養(yǎng)細(xì)胞等簡(jiǎn)單醫(yī)療樣本，樣本類型多，成分復(fù)雜，雜質(zhì)含量高，對(duì)樣本裂解效率有很大影響。2. 病毒含量較低，相應(yīng)的對(duì)提取效率的要求就很高，要求提取得率盡量高，能夠滿足后續(xù)檢測(cè)的要求。3. 樣本中RNA酶會(huì)在提取過程中導(dǎo)致病毒RNA降解。因此，在提取時(shí)需選用得率高、純度高的試劑盒。此外，在提取過程中，對(duì)操作人員的要求也比較高，在提取之前應(yīng)進(jìn)行整體培訓(xùn)，避免操作錯(cuò)誤或引入RNA酶等雜質(zhì)。

 

獲取核酸之后，RT-qPCR檢測(cè)nCov病毒核酸也有需要注意的幾點(diǎn)：1. 盡量提高檢測(cè)分辨率，能夠檢出低豐度的核酸模板，避免假陰性。2. 盡量提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率，避免非特異性信號(hào)造成假陽(yáng)性。3. 盡量提高檢測(cè)穩(wěn)定性，對(duì)于同一核酸樣本的檢測(cè)結(jié)果平行性好。此外，定量實(shí)驗(yàn)的速度也是整體病毒檢測(cè)速度中的決定因素，應(yīng)選擇操作簡(jiǎn)便、速度快的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

 

天根生化科技（北京）有限公司作為中國(guó)核酸提取和檢測(cè)試劑上游供應(yīng)的領(lǐng)軍企業(yè)，多次為國(guó)家病毒性流行�。ㄈ缡肿憧诓《尽⒓仔虷1N1流感病毒、非洲豬瘟病毒疫情等）的診斷及預(yù)防提供幫助。目前天根生化正在持續(xù)為全國(guó)三十多家檢測(cè)單位提供病毒核酸提取、熒光定量檢測(cè)試劑以及相關(guān)儀器設(shè)備。

 

 

 

DP315-R擁有獨(dú)特的裂解液RL，能夠應(yīng)對(duì)冠狀病毒檢測(cè)的各類樣本：血液、血清/血漿、組織、拭子、病毒等，裂解效率高，抗逆性強(qiáng)，還含有保護(hù)成分，避免RNA降解。試劑盒中特別配備了Carrier RNA用于充分收集微量RNA，提取得率高，最大限度的捕獲病毒核酸。此外，離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料為本公司特有新型材料，高效、專一吸附RNA，可最大限度去除雜質(zhì)蛋白等，提高收集的核酸純度。

 

• 高效率：快速純化得到高質(zhì)量病毒RNA，重復(fù)性高

• 高得率：Carrier RNA收集微量核酸，提取靈敏度高，得率高

• 高純度：完全抵抗和去除污染物和抑制劑，方便下游應(yīng)用

• 高安全性：無有機(jī)試劑抽提或乙醇沉淀

 

 

 

 

FP314特別為檢測(cè)樣本中的微量基因和微量RNA病毒設(shè)計(jì)。試劑盒集成了反轉(zhuǎn)錄和熒光定量模塊，一步完成從反轉(zhuǎn)錄到定量的全部操作，操作簡(jiǎn)單、快速。試劑盒中使用的King反轉(zhuǎn)錄酶和新型抗體修飾的Taq聚合酶均為新型工程酶，模板識(shí)別靈敏度高，抗逆性強(qiáng)，特別適合復(fù)雜環(huán)境中低豐度RNA模板的檢測(cè)。本試劑盒是基于探針法設(shè)計(jì)，配合官方公布的引物和探針，對(duì)nCov病毒核酸的檢測(cè)具有極高的準(zhǔn)確率。

 

• 高效：性能優(yōu)良的逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶保證了極高的反應(yīng)效率

• 靈敏：低至1 ng 的模板也能被準(zhǔn)確識(shí)別，特別適合低豐度模板

• 抗逆：通讀GC含量高，二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的RNA模板

• 普適：對(duì)不同物種來源及雜質(zhì)較多的RNA模板的適用性高