定量代謝分析在代謝類疾病治療與預(yù)防中的應(yīng)用

健 康
 

肥胖、糖尿病、心血管疾病以及其他代謝綜合征范疇內(nèi)的相關(guān)疾病，是關(guān)系到我們健康最緊迫的問題，其中代謝相關(guān)的激素由內(nèi)分泌系統(tǒng)的各個器官，包括脂肪細胞、胰腺和胃腸道分泌。在調(diào)節(jié)能量、食物攝取量和全身代謝方面發(fā)揮著重要作用。

 

近些年，隨著II型糖尿病的發(fā)病率上升，代謝類疾病甚至已經(jīng)影響到兒童和青少年人群。所以加快代謝綜合征相關(guān)的激素研究，對代謝類疾病的治療和預(yù)防都至關(guān)重要。

 

因為維持系統(tǒng)的平衡狀態(tài)需要多個信號分子，所以沒有一個生物標志物足以定義一個系統(tǒng)。另一方面，基于傳統(tǒng)的檢測手段，由于樣本容量的限制，一次測量多個分析物是難以完成的。

▲圖1：各種器官向大腦分泌的多種信號有助于維持食物攝入和能量消耗之間的平衡，調(diào)節(jié)體重和新陳代謝

  

為了克服這些挑戰(zhàn)，基于Luminex®xMAP®磁珠技術(shù)的MILLIPLEX®MAP多因子檢測試劑盒，可以實現(xiàn)同時定量代謝相關(guān)分析¹。MILLIPLEX®代謝激素檢測試劑盒的主要優(yōu)勢是包含：總GLP-1的檢測和活性GLP-1的高靈敏度檢測。 

產(chǎn)品詳情

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在此案例中，我們向您介紹一個多重、穩(wěn)定、靈敏的代謝激素多因子檢測試劑盒，可以同時檢測包括如下13種代謝激素： 

● 胰島激素	amylin (active or total)， C-peptide, glucagon, insulin 與pancreatic polypeptide (PP)
● 胃腸激素	active ghrelin, gastric inhibitory peptide (GIP), glucagon-like peptide 1 (GLP-1, active or total), 與 peptide YY (PYY)
● 脂肪因子	leptin, IL-6, monocyte chemotactic  protein-1 (MCP-1), 與 tumor necrosis factor(TNF )

 

除了評估整個試劑盒的準確性和精密度外，我們還比較了MILLIPLEX^®活性GLP-1高靈敏度試劑盒與默克金標準高靈敏度活性GLP-1的ELISA法試劑盒，得到的檢測結(jié)果一致（貨號：EZGLPHS-35K）。

 

1 材料和方法

實驗檢測使用：MILLIPLEX^®人類代謝激素檢測試劑盒(貨號：HMHEMAG-34K)，實驗按照試劑盒說明書進行操作。

 

為了確定代謝激素水平與食物攝入量的關(guān)系，我們采集了正常受試者(n=20)在禁食一晚或標準早餐后一小時的血液樣本。在采集的血樣中立即加入蛋白酶抑制劑(DPPIV抑制劑、AEBSF、蛋白酶抑制劑)。根據(jù)檢測方案，使用MILLIPLEX^®人代謝激素試劑盒，對血清和血漿樣品進行分別進行檢測。

 

同時，針對同一份樣本使用默克公司高靈敏度GLP-1 ELISA試劑盒(貨號：EZGLPHS-35K)進行檢測，按照試劑盒說明書進行操作。

 

2 結(jié) 果

使用血清基質(zhì)中連續(xù)稀釋的每種分析物的標準，制備標準曲線，以測定相對于分析物濃度的測定反應(yīng)(以平均熒光強度[MFI]測量)(圖2B)。

 

標準曲線為所有因子設(shè)定用于檢測的線性度超過3~5個數(shù)量級（圖2A），試劑盒內(nèi)所有因子未見交叉反應(yīng)(數(shù)據(jù)未展示)。根據(jù)檢測數(shù)據(jù)顯示，MILLIPLEX^®回收率達94%~107%，精度好(小于10%的板內(nèi)變異系數(shù)[CV]和15-20%的板間變異系數(shù)(圖2A)。

 ▲ 圖2A

 

▲圖2B:驗證數(shù)據(jù)(2A)和標準曲線(2B)使用血清基質(zhì)稀釋，并使用MILLIPLEX®MAP 人類代謝激素試劑盒（Cat. No. HMHEMAG-34K）

 

接下來，我們評估了MILLIPLEX^®試劑盒檢測生物樣品的性能。

 

正如之前的預(yù)期，多種代謝激素水平會隨著食物的攝入而發(fā)生變化(血清中C-Peptide, GIP, active GLP-1與Insulin水平升高，如圖3A所示)。將匹配的人血清和血漿樣本進行比較，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)分析物的血清和血漿樣本濃度非常接近(數(shù)據(jù)如圖3B所示)。

▲圖3：使用MILLIPLEX^®多因子試劑盒檢測人類空腹或餐后受試者血清(樣本中已加蛋白酶抑制劑)和血漿中的代謝激素。血清C-Peptide, GIP, active GLP-1和Insulin (3A)均有預(yù)期升高。從相關(guān)曲線(3B)中的斜率和R值可以看出，血清分析物水平與血漿分析物水平比較具有良好的相關(guān)性

 

我們分別使用MILLIPLEX^®人類代謝激素檢測試劑盒與目前已證實穩(wěn)定的默克高敏活性GLP-1 ELISA試劑盒同時進行檢測，并比較了活性GLP-1的定量檢測結(jié)果（圖4）：
 

● 使用GLP-1重組蛋白，按照一定比例進行梯度稀釋建立標準曲線，最終顯示出幾乎一致的反應(yīng)結(jié)果數(shù)據(jù)和分析的線性范圍(圖4A)；
● 使用MILLIPLEX^®多因子技術(shù)與ELISA技術(shù)分別檢測生物樣品中GLP-1的表達水平，并進行比較后(圖4B)，顯示這兩種方法檢測結(jié)果具有很好的相關(guān)性。

 

▲圖4：MILLIPLEX^® GLP-1(活性)檢測結(jié)果與GLP-1(活性)ELISA檢測結(jié)果(4A)的相關(guān)性，血清樣本(4B)和空腹與餐后受試者的比較(4C和4D)

 

 

3 討 論 

通過以上的實驗結(jié)果，MILLIPLEX^®人類代謝激素檢測試劑盒與其他商業(yè)上可用的多重檢測試劑盒進行比較，該試劑盒操作更加友好、結(jié)果更加準確，檢測性能與其他供應(yīng)商的試劑盒相似或更好。該代謝相關(guān)激素檢測試劑盒，在代謝疾病和其他相關(guān)病理生理學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和臨床研究中，有潛力成為一個非常有用的工具。

 

代謝研究相關(guān)MILLIPLEX^®試劑盒▼

Name	Analytes	Cat. No.
Human Adipokine Panel 1 (Serum/Plasma samples)	Adiponectin, Adipsin/FactorD/NGAL/Lipocalin-2, PAI-1 (total), Resistin	HADK1MAG-61K
Human Adipokine Panel 2 (Serum/Plasma samples)	HGF, IL-1β, IL-6, IL-8/CXCL8, Insulin, Leptin, MCP-1/CCL2, NGF, TNFα	HADK2MAG-61K
Human Adipocyte (Cell culture samples)	Adiponectin, HGH, IL-1β , Il-6, IL-8/CXCL8, Leptin, MCP-1/CCL2, NGF,PAI-1  (total), Resistin, TNFα	HADCYMAG-61K
Human            Myokine	Apelin, BDNF, Erythropoietin (EPO), FABP3, FGF21, Fractalkine/CX3CL1,FSTL1, IL-6, IL-15, Irisin, LIF, Myostatin/GDF8, Oncostatin-M (OSM),Osteocrin/Musclin, Osteonectin/SPARC	HMYOMAG-56K
Human Pituitary Panel 1	ACTH, Agouti-Related Protein (AgRP), CNTF, FSH, GH, LH, TSH	HPTP1MAG-66K
Multi-Species Steroid/Thyroid Hormone	Cortisol, Estradiol, Progesterone, T3, T4,Testosterone	MSHMAG-21K

 

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參考文獻

 

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