新蛋白質(zhì)交聯(lián)抗體的標記和修飾使用方法
介紹
現(xiàn)在的研究中，一個大生物分子與另一個大分子的共價結(jié)合，如抗體與酶或酶與DNA的共價結(jié)合，仍是研究人員實驗中的重點之一。其中有幾種方法可用于交聯(lián)兩個生物分子。一種常見的方法是使用一種小分子交聯(lián)劑（如Sulfo-SMCC）。SMCC的一端有胺反應性NHS酯基與蛋白質(zhì)的游離胺（-NH2）反應，另一端有巰基反應性馬來酰亞胺基與要結(jié)合的生物分子的巰基（-SH）反應，從而形成綴合物。 蛋白質(zhì)上的SMCC修飾的連接基極不穩(wěn)定，并且經(jīng)常自反應，因為蛋白質(zhì)通常同時包含游離胺基和巰基，所以會導致大量的相同蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應。 另外，蛋白質(zhì)上馬來酰亞胺基團的數(shù)量的定量非常繁雜，而且很難確定兩個生物分子在反應中的適當摩爾比，以獲得理想的功能和綴合效率。
目前AAT Bioquest已經(jīng)開發(fā)了一種方便有效的交聯(lián)方法以高綴合產(chǎn)率連接兩個生物分子。該方法使用兩種獨特的交聯(lián)劑（Buccutite MTA和Buccutite FOL），MTA和FOL在蛋白質(zhì)上的交聯(lián)劑易于控制和定量。 在脫鹽柱上除去游離的連接物后，在溫和條件下混合，Buccutite MTA活化的抗體和BuccutiteFOL修飾的蛋白質(zhì)。 純化基本上是不需要的，并且反應不會發(fā)生相同蛋白質(zhì)交聯(lián)。
實驗材料
- 抗體和酶：山羊抗小鼠IgG和小鼠IgG來自Jackson Immuno Research Laboratories；HRP來自Calzyme，微管蛋白小鼠mAb來自Life Technologies。
- 純化柱：所有純化柱均為Bio-Rad的Bio-Spin尺寸柱。
- 細胞成像：HeLa細胞用4％甲醛固定，并用Mouse Anti-tubulin染色，然后用HRP-山羊-抗小鼠IgG綴合物染色。最后用Olympus IX71熒光顯微鏡拍攝圖像。
綴合原理
- 用MTA激活山羊抗小鼠IgG，并用FOL修飾蛋白（APC或PE）（1小時）。
- 活化的IgG和修飾的蛋白用旋轉(zhuǎn)柱純化（5分鐘）。
- 將激活的抗體和修飾的蛋白混合（30分鐘）。
- 用所需的綴合物染色細胞，無需進一步純化。
圖1. Buccutite 抗體-蛋白質(zhì)綴合過程。
結(jié)果
用于ELISA檢測的Buccutite HRP-IgG綴合物
圖2.通過使用Buccutite 交聯(lián)方法（紅色）和SMCC方法（藍色）制備HRP-山羊-抗小鼠IgG綴合物生成的ELISA曲線圖。將小鼠單克隆抗體（100 ng）包被在96孔板上，用標準方法將GAM IgG-HRP綴合物稀釋2倍。然后使用ABTS底物溶液（＃11001，AAT Bioquest）孵育30分鐘，檢測固定的小鼠IgG，并在405 nm處讀數(shù)。
用于細胞成像的Buccutite IgG-RPE綴合物
圖3.微管蛋白在HeLa細胞中使用RPE-山羊-抗小鼠IgG綴合物染色的熒光圖像。用小鼠抗α-微管蛋白抗體將微管蛋白染色，并用如上所述的Buccutite 交聯(lián)方法制備紅色熒光RPE-山羊-抗小鼠IgG綴合物，最后在顯微鏡下觀察。
染料說明
- 交聯(lián)劑非常穩(wěn)定，Buccutite 交聯(lián)反應試劑激活的大分子非常穩(wěn)定，可以在4ºC下保存超過24個月。
- 綴合條件非常簡單，Buccutite 綴合物可以在很寬的pH值、濃度和溫度下實驗，且不需要催化劑。
- 高效，Buccutite 綴合可在1小時內(nèi)完成。在相同條件下，與其他現(xiàn)有方法相比，Buccutite 綴合反應具有更高的效率。綴合可以在極低的濃度下進行。
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