等溫擴(kuò)增時出現(xiàn)假陽性的應(yīng)對策略

等溫擴(kuò)增技術(shù)作為一種核酸分子診斷技術(shù)，從誕生之日起就不斷受到研究者的青睞，但也少不了質(zhì)疑，甚至摒棄。引起這種截然相反的態(tài)度的原因在于等溫擴(kuò)增技術(shù)自身所存在的缺陷。而最為突出的一點是，在建立方法或者實際樣本檢測的過程中，等溫擴(kuò)增技術(shù)引起假陽性結(jié)果的概率相對較高，使得其實際應(yīng)用范圍變窄，未能真正顯示出其檢測優(yōu)勢。因此，推出這經(jīng)驗篇來回答“當(dāng)?shù)葴財U(kuò)增出現(xiàn)假陽性時應(yīng)該如何應(yīng)對？”。

01假陽性現(xiàn)象  

假陽性是指檢測陰性材料得到陽性結(jié)果。如果一次實驗中的幾個陰性對照中出現(xiàn)一個或幾個陽性結(jié)果，提示本次實驗中其它標(biāo)本的檢測結(jié)果可能有假陽性。實驗中設(shè)立的陰性對照可提示有無假陽性結(jié)果出現(xiàn)。

02  造成假陽性的原因  

1. 樣品間交叉污染：樣本污染主要有收集樣本的容器被污染，或樣本放置時，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有樣本而造成相互間交叉污染；樣本核酸模板在提取過程中，由于吸樣*污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染； 

2. 擴(kuò)增產(chǎn)物污染：這是反應(yīng)中最主要最常見的污染問題。因為擴(kuò)增產(chǎn)物拷貝量大，所以極微量的產(chǎn)物污染，就可形成假陽性。

3. 氣溶膠污染：在空氣與液體面摩 擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管，開蓋時、吸樣時及污染進(jìn)樣*的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計算一個氣溶膠顆�？珊�48000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。 

4. 實驗室中克隆質(zhì)粒的污染：由于克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長繁殖的簡便性及具有很強(qiáng)的生命力，其污染可能性也很大。在分子生物學(xué)實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗室，這個問題比較常見。 

03  假陽性問題的試驗控制  

在擴(kuò)增檢測時，可設(shè)立陰性對照樣品和陽性對照樣品。陰性對照樣品檢測為陰性時，表明試驗全部過程的試劑沒有受到污染；陽性對照樣品檢測為陽性時，表明DNA提�。≧NA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄）、DNA擴(kuò)增和電泳鑒定工作體系正常。在陰性對照樣品和陽性對照樣品檢測結(jié)果成立的前提下，才能對檢測樣品進(jìn)行判定。只有設(shè)立試驗全程的對照，才能證明試驗結(jié)果成立。 

造成假陰性的原因可以通過設(shè)置試驗對照來查找。

試驗對照包括： 

1、DNA陽性對照：以含有目的片段的DNA(或質(zhì)粒）作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，證明試劑是否有效、擴(kuò)增過程是否正確及待測樣品中是否含有目的片段。（注意：陽性樣品擴(kuò)增效率高，應(yīng)嚴(yán)格控制，避免其成為潛在的污染源）。

2、DNA陰性對照：以不含有目的片段的陰性樣品作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，用于證明擴(kuò)增過程中無假陽性現(xiàn)象。

3、空白對照：以純水作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，用于證明擴(kuò)增過程中無假陽性現(xiàn)象。

4、等溫擴(kuò)增抑制物對照：在與陽性對照相同的反應(yīng)體系中，加入相同數(shù)量的待測樣品DNA，如果未擴(kuò)增出目的片段，證明此待測樣品DNA中存在擴(kuò)增抑制物。 

5、空白提取對照：空白提取對照擴(kuò)增結(jié)果為陽性，說明DNA提取試劑可能受到污染。 

6、陽性提取對照：陽性提取對照擴(kuò)增結(jié)果為陰性，說明提取過程可能有誤。 如果DNA陽性對照擴(kuò)增結(jié)果為陰性，或者DNA陰性對照和空白對照擴(kuò)增結(jié)果為陽性，則說明PCR試劑或擴(kuò)增過程存在問題。 

04  假陽性解決途徑  

由于擴(kuò)增的敏感性和效率特別高，所以少量的擴(kuò)增產(chǎn)物污染標(biāo)本或反應(yīng)管即可出現(xiàn)假陽性。尤其是擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒分子很容易造成實驗室的污染，導(dǎo)致假陽性現(xiàn)象發(fā)生。 

1、規(guī)范實驗室設(shè)計 

實驗室設(shè)置上分配液區(qū)、DNA提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)。物流應(yīng)按分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)順序，嚴(yán)禁倒流。在連續(xù)而獨立的空間中完成不同實驗步驟。不同工作區(qū)域相互隔離，通過傳遞倉傳遞。 

2、規(guī)范試劑耗材管理 

1）驗證：新買的試劑需進(jìn)行實驗前驗證； 

2）分裝：雙蒸水、引物和dNTP均應(yīng)分裝儲存，并標(biāo)明日期，以防污染；試劑的分裝應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺上進(jìn)行；試劑分裝成小份一次使用后棄去。 

3）消毒：除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。必要時，在加樣本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。 

3、規(guī)范實驗室操作 

1）控制污染源：擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒操作空間是最大的污染源，應(yīng)嚴(yán)格防止將這個空間的物品帶出；

2）一次性用具：使用實驗服和一次性手套，使用帶有濾膜的移液器*頭，一次性反應(yīng)管和離心管； 

3）定期消毒：定期對實驗室進(jìn)行紫外照射，用10%漂白劑、3％雙氧水或?qū)Ｓ蒙虡I(yè)產(chǎn)品清理實驗室臺面及死角。 

4）定期通風(fēng)：對實驗室定期進(jìn)行正壓、負(fù)壓通風(fēng)處理；

5）小心操作：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣*內(nèi)或濺出離心管外；加樣時，最后加陽性對照。 
 

05 面對實驗的假陽性個人建議  

1、端正心態(tài)，堅持不懈地探索。

2、引物設(shè)計要過關(guān)。

3、關(guān)注Bst DNA聚合酶的選擇和質(zhì)量。

4、關(guān)注dNTPs的質(zhì)量。dNTPs建議分裝保存在-20℃。低質(zhì)量的dNTPs不僅導(dǎo)致陽性擴(kuò)增效率下降，還能引起非特異性擴(kuò)增，即假陽性結(jié)果。

5、關(guān)注引物的質(zhì)量。如果是引物質(zhì)量引起的假陽性。

解決的對策有：

（1）提高純化級別至HPLC，以排除引物干粉摻雜物對體系的影響；

（2）選擇質(zhì)量過硬的合成機(jī)構(gòu)；

（3）嚴(yán)格遵循引物保存的條件：干粉和高濃度引物液-20℃可保存數(shù)月；非干粉和工作濃度引物液4℃保存不超過一周。

6、優(yōu)化反應(yīng)體系。對于等溫擴(kuò)增技術(shù)而言，優(yōu)化反應(yīng)體系是解決假陽性擴(kuò)增最為直接、有效的方法。當(dāng)然，在進(jìn)行體系優(yōu)化前，要保證所有體系成分都不會引起假陽性。換言之，要確認(rèn)好是反應(yīng)體系配方引起的假陽性。

7、樣本成分耐受性影響。在建立等溫擴(kuò)增技術(shù)時我們往往會忽略實際樣本成分給擴(kuò)增帶來的影響。由于實際樣本絕非是純的核酸樣本，縱使用最好的純化試劑盒，部分樣本成分仍然會出現(xiàn)在最終提取液中。這些樣本成分包括尿素、尿酸、血清、血清、膽汁酸等，在等溫擴(kuò)增時會使陽性反應(yīng)速率變慢，誘發(fā)假陽性擴(kuò)增或假陰性結(jié)果。因此，一個好的檢測試劑盒，必須對一定量的樣本成分有很好的耐受性。建議在方法構(gòu)建好之后，進(jìn)行實際樣本檢測或者模擬實際樣本檢測等實驗。

04 總結(jié)  

上述建議并非是解決假陽性問題的黃金鑰匙，可做大家參考。相信其他從事等溫擴(kuò)增研究的人也都有其解決假陽性問題的經(jīng)驗與方法。彼此經(jīng)驗共享對于等溫擴(kuò)增研究領(lǐng)域的健康發(fā)展是至關(guān)重要的。如果你恰巧有這方面的經(jīng)驗或者問題，不妨關(guān)注我們公眾號告知我們，我們會將經(jīng)驗共享于大家，將問題與大家一起探討，讓彼此也少走些彎路。