多功能平鋪光片顯微鏡在透明組織成像應用中的優(yōu)勢

 
生物組織的高分辨率3D熒光成像在亞細胞、細胞和組織水平上為基因表達、細胞形態(tài)和細胞在組織中的分布研究搭建了橋梁。組織透明化方法將生物組織透明，并結合最新的3D熒光成像技術實現(xiàn)了組織結構可視化。

盡管這種結合有諸多好處，但在3D組織成像應用中仍存在挑戰(zhàn)：(1)在對厘米級樣本進行微米級或更高分辨率成像時，傳統(tǒng)光片顯微鏡成像效率不高；(2)傳統(tǒng)光片顯微鏡難以兼容所有的組織透明化方法透明的樣本；(3)不能實時校正由不同成像液的折射率變化引起的偏差，優(yōu)化不同樣品的成像性能；（4）顯微鏡儀器校準程序復雜且較為困難。2020年11月3日，西湖大學高亮實驗室團隊在Cell Reports上發(fā)表文章A Versatile Tiling Light Sheet Microscope for Imaging of Cleared Tissues，介紹了一款具有半自動校準能力的多功能平鋪光片顯微鏡，它能夠對所有組織透明化方法透明的樣本組織進行多色快速3D成像，并且成像的空間分辨率達微米級（4×4×10μm³）甚至亞微米級（0.3×0.3×1μm³）。另外，通過組織膨脹技術，平鋪光片顯微鏡的分辨能力可提高至小于100nm（70×70×200 nm³）。

文章指出，平鋪光片技術很好地解決了上述問題。不同于其他的光片顯微鏡，平鋪光片顯微鏡不僅在透明化大組織樣本的3D成像上呈現(xiàn)更好的效果，而且可以大范圍內更加簡單的優(yōu)化和調節(jié)成像品質，可以更方便的應用在不同領域。

那么，與其他的光片顯微鏡相比，平鋪光片顯微鏡有哪些特點呢？
1） 和傳統(tǒng)的光片顯微鏡相比，相同的成像時間里，采用平鋪光片顯微鏡成像樣本可提高空間分辨率以及成像效率。
2）通過變換不同NA的檢測物鏡，放大倍數(shù)，以及調整激發(fā)光片，平鋪光片顯微鏡可以實現(xiàn)對厘米級的組織樣本進行從微米級到亞微米級空間分辨率的成像，而利用組織膨脹技術可以進一步提高成像分辨率。
3）通過空間光調制器對激發(fā)光片進行相位調制，用于創(chuàng)建和優(yōu)化樣品照明的平鋪光片。
4）顯微鏡具有半自動校準功能，保證了成像的準確性、可靠性和易用性；
5）顯微鏡與所有的組織透明化方法兼容，適用于不同形狀，不同機械強度的組織成像。
6）不同的透明化組織樣本可以在幾分鐘內快速更換成像；
7）可以對透明化組織進行多分辨率級別、各向同性、多色三維成像；
憑借上述優(yōu)點，平鋪光片顯微鏡對組織樣本進行3D成像的結果又如何呢？

1）實現(xiàn)微米級空間分辨率的3D組織成像
具有近乎各向同性的微米級空間分辨率的3D組織成像非常適合在細胞水平上可視化組織結構。如圖1所示，3小時內獲取的小鼠腦血管網(wǎng)絡展示了識別到的幾乎所有的毛細血管。成像結果可對腦血管結構提供清晰的拓撲結構闡釋。根據(jù)成像結果提取到的數(shù)據(jù)顯示大腦皮層中這些穿透性的血管可通過毛細血管與位于胼胝體區(qū)域的海馬內小靜脈或小動脈相連接。因此，平鋪光片顯微鏡卓越的3D成像能力可以輔助了解整腦不同腦區(qū)的血管網(wǎng)絡分布。

 

2）多色3D組織成像能力
多色3D成像技術對研究組織內部不同細胞器的相對分布有極大幫助。平鋪光片顯微鏡具有對所有波段的激發(fā)光進行相位調制的功能，可以確保不同激發(fā)光束共線校正，從而確保不同顏色通道采集圖像的精確配準。本文通過雙色標記的小鼠乳腺成像來檢測顯微鏡的多色3D成像能力。圖2（A-Y）小鼠乳腺雙色成像結果表明可以清晰分辨位于乳腺管內層的腔細胞，及乳腺管外層的基底細胞。這兩者的相對表達體現(xiàn)了乳腺導管和末端芽的不同分布模式，結果表明了乳腺細胞組成的空間異質性。
圖2（Z-GG）展示了對人類的乳腺癌組織和相鄰的正常乳腺組織進行成像。從實驗表達結果可以看出，腫瘤組織失去了原有腺泡結構僅有異常的管狀結構，并顯示出具有利于癌細胞浸潤的密集血管脈絡系統(tǒng)。該患者的淋巴結腫大并伴有可疑的浸潤細胞，這與脈管系統(tǒng)異常的表征相符。該組實驗表明組織透明化和高分辨率3D組織成像技術在病理學應用中的價值。


3）亞微米級空間分辨率的3D組織成像
   為觀察亞細胞組織結構，將平鋪光片顯微鏡的檢測物鏡提升至1.0NA，照明物鏡提升至0.28NA，產生1um薄光片對樣本進行成像。如圖3所示，成像結果呈現(xiàn)出高倍顯微鏡具有很好的亞細胞神經元結構的分辨能力，我們可以觀察到興奮性錐體神經元、神經元軸突上清晰可辨的樹突棘和單個神經元的形態(tài)。


4）組織膨脹的亞微米級空間分辨率的3D組織成像
組織膨脹技術提供了一種比顯微鏡更高的空間分辨率來分辨組織結構的解決方案。實驗研究了平鋪光片顯微鏡與組織膨脹技術結合的成像能力。Thy1-eGFP小鼠腦透明化使用組織膨大技術將樣本各向同性擴大5倍，成像空間分辨率為2um×2um×5um，那么同等的空間分辨率根據(jù)5倍膨脹比例，映射到對實際樣本的分辨能力是0.4um×0.4um×1um。成像結果如圖4所示，小鼠大腦海馬區(qū)細胞和亞細胞神經元結構清晰可見，盡管海馬區(qū)細胞密度較高，依舊可以分解出單個神經元軸突和樹突棘。同時，如圖4虛線框內標識可以觀察到一些神經軸突的神經間的軸漿運輸。

 
5) 用組織膨脹技術實現(xiàn)100nm以下空間分辨率的3D組織成像
平鋪光片顯微鏡通過采用更高NA的檢測物鏡和更薄的光片對膨脹組織成像，能夠達到100nm以下的空間分辨率，從而實現(xiàn)對組織結構的進一步解析。
圖5采用0.8NA的檢測物鏡以及更薄的激發(fā)光片展示了更精細的神經結構。研究結果表明，大腦神經網(wǎng)絡極其復雜，納米尺度空間分辨率的3D成像對完全解析大腦神經網(wǎng)絡是非常必要的。

  6) 具有多分辨率尺度的三維組織成像
  平鋪光片顯微鏡的優(yōu)勢是可以為其他生物組織的研究提供幫助。圖6展示了平鋪光片顯微鏡對透明化的真渦蟲以從微米到亞微米多種空間分辨率成像的結果。整體成像結果展示了干細胞在真渦蟲內的整體分布，局部高空間分辨率成像結果展示了真渦蟲內干細胞組織以及細胞與細胞之間的相互作用關系。因此，平鋪光片顯微鏡可以更好地研究真渦蟲干細胞的分布和功能。類似的優(yōu)點同樣適用于其他生物研究，例如秀麗隱桿線蟲，黑腹果蠅，斑馬魚等。

 
 
結論
綜上所述，本文開發(fā)了一款多功能平鋪光片顯微鏡，具有卓越的多色3D成像能力，能夠以微米級至100nm以下的空間分辨率對厘米級的透明化樣本組織進行快速3D成像。該顯微鏡兼容所有的組織透明化方法，靈活適應不同的應用。它還具有通過相位調制實現(xiàn)半自動對準的能力，操作簡單可靠。因此，平鋪光片顯微鏡使得3D透明化組織成像在生物醫(yī)學研究中更加可靠及可行。
 
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文獻鏈接：:https://doi.org/10.1016/j.celrep.2020.108349