病理切片制作技術(shù)的基本方法

【實(shí)驗(yàn)原理】
采用光學(xué)顯微鏡研究一般生物體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，在自然狀態(tài)下是無法觀察清楚的，多數(shù)動(dòng)、植物材料都必須經(jīng)過某種處理，將組織分離成單個(gè)細(xì)胞或薄片，光線才能通過細(xì)胞。為了適應(yīng)這個(gè)需要，就產(chǎn)生了光學(xué)顯微鏡制片技術(shù)。
光學(xué)顯微鏡的制片技術(shù)方法可分為兩大類：一類是非切片法，另一類是切片法。
非切片法，是用物理或化學(xué)的方法，使細(xì)胞彼此分離，如有分離法、涂布法、壓碎法等。非切片法的操作比較簡(jiǎn)單，能保侍細(xì)胞的完整，但是細(xì)胞之間的正常位置往往被更動(dòng)，無法反映細(xì)胞之間的正常聯(lián)系。它可以與切片法配合使用，各取其長(zhǎng)處。
切片法，是利用銳利的刃具將組織切成極薄的片層，材料須經(jīng)過一系列特殊的處理，如固定、脫水、包埋、切片、染色等，過程十分繁復(fù)。在制作過程中，還要經(jīng)過一系列的物理和化學(xué)的處理，這些處理方法可根據(jù)各種不同材料的性質(zhì)要求進(jìn)行合理選擇。切片法雖然工序繁瑣，技術(shù)復(fù)雜，但是，它最能保持細(xì)胞間的正常的相互關(guān)系，能較好和較長(zhǎng)時(shí)間地保留細(xì)胞的原貌，所以仍然是光學(xué)顯微鏡的主要制片方法。

【方法與步驟】
光學(xué)顯微鏡切片制作技術(shù)最簡(jiǎn)單的切片法是徒手切片，但是由于組織塊往往十分柔軟，
切削很困難，而且無法得到十分菲薄的切片，因此必須先用某些特殊物質(zhì)滲入組織塊的內(nèi)部起支持作用，并將整個(gè)組織塊包住，然后再用精密的切片機(jī)制作切片，才能獲得良好的效果。這種方法稱為包埋法，包埋的物質(zhì)稱為包埋劑。分別有石蠟切片、火棉膠切片、冰凍切片等，它們各有長(zhǎng)處，可以根據(jù)需要選用，但是使用得最多的還是石蠟切片技術(shù)。
石蠟作為包埋劑，有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，例如：石蠟?zāi)芮谐鰳O薄的蠟片（2～10μm）；切片時(shí)能連成蠟帶，便于制作連續(xù)切片；操作較容易，組織塊可以包埋在石蠟中長(zhǎng)期保存。然而石蠟切片的制作過程較長(zhǎng)，步驟很多，一步不慎往往導(dǎo)致前功盡棄，而且這些處理引起組織塊或多或少地收縮，切片時(shí)受濕度影響比較大，這些不足之處必須在制片過程中認(rèn)真對(duì)待，盡量減小它的不良影響。
石蠟切片的制作過程主要包括：取材，固定，脫水，透明，透蠟，包埋，切片，貼片，染色，透明，封藏等步驟。
1．取材
材料的好壞直接影響到切片的質(zhì)量，以下幾點(diǎn)是必須注意的。
取材必須新鮮，這一點(diǎn)對(duì)于從事細(xì)胞生物學(xué)研究尤為重要，應(yīng)該盡可能割取生活著的組織塊，并隨即投入固定液。切取材料時(shí)刀要銳利，避免因擠壓細(xì)胞使其受到損傷。切取的材料應(yīng)該小而薄，便于固定劑迅速滲入內(nèi)部。一般厚度不超過2mm，大小不超過5×5mm2。
2．固定
組織和細(xì)胞離開機(jī)體后，在一定時(shí)間內(nèi)仍然延續(xù)著生命活動(dòng)，會(huì)引起病理變化直至歸于死亡。為了使標(biāo)本能反映它生前的正常狀態(tài)，必須盡早地用某些化學(xué)藥品迅速地殺死組織和細(xì)胞，阻抑上述變化，并將結(jié)構(gòu)成分轉(zhuǎn)化為不溶性物質(zhì)，防止某些結(jié)構(gòu)的溶化和消失。這種處理就是固定。除了上述作用外，固定劑會(huì)使組織適當(dāng)硬化以便于隨后的處理，還會(huì)改變細(xì)胞內(nèi)部的折射系數(shù)并使某些部分易于染色。
固定劑的作用對(duì)象主要是蛋白質(zhì)，至于其他成分如脂肪和糖，在一般制作時(shí)不加考慮，如要觀察這些物質(zhì)，可用特殊的方法將其固定下來。
固定劑的作用表現(xiàn)在對(duì)材料體積的改變、硬化的程度、穿透的速度以及對(duì)染色的影響等方面。這些作用的好壞、大小，都依所固定的材料性質(zhì)而定，同樣一種固定液對(duì)某一材料來說是良好的，但對(duì)另外一些組織可能就不很適用。良好的固定劑必須具備的特征是：穿透組織的速度快。，能將細(xì)胞中的內(nèi)含物凝固成不溶解物質(zhì)，不使組織膨脹或收縮以保持原形，硬化組織的程度適中，增加細(xì)胞內(nèi)含物的折光度，增加媒染和染色能力，具有保存劑作用。 固定劑有簡(jiǎn)單固定劑和混合固定劑的劃分。
簡(jiǎn)單固定劑即單一的固定劑，常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀和鋨酸。其中，苦味酸、升汞、鉻酸既能凝固細(xì)胞清蛋白，又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白，而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、餓酸和重鉻酸鉀對(duì)這兩種蛋白質(zhì)都不凝固。
簡(jiǎn)單固定劑的局限性較大，如將其適當(dāng)混合，制成復(fù)合固定劑可以取得更好的效果。常用的混合固定劑有：
Bouin液（70份苦味酸飽和水溶液+25份4％甲醛+5份冰醋酸）、Zenker液（升汞5g＋重鉻酸鉀2.5g＋硫酸鈉1.0g＋5ml冰醋酸＋100ml蒸鎦水）、Carnoy改良液（3份無水乙醇+1份冰醋酸）等。固定劑的種類甚多，我們必須依據(jù)各種固定劑的性能及制片的不同要求來加以選擇。

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固定時(shí)，須注意以下幾點(diǎn)：
（1）固定劑應(yīng)有足夠的量，一般為組織塊體積的10～15倍。
（2）如所固定的材料外表有不易穿透的物質(zhì)，可將材料先在含乙醇的溶液中固定幾分鐘，再移入水溶性的固定液。
（3）材料固定后如不立即下沉，可將其中氣泡抽出。
（4）固定時(shí)間依材料大小、固定劑種類而異，可從1小時(shí)到幾十小時(shí)，有時(shí)中間需要更新固定劑。某些固定劑對(duì)組織的硬化作用較強(qiáng)，作用時(shí)間應(yīng)嚴(yán)加控制，不能過長(zhǎng)。
（5）一般固定劑都以新配制的為好，用過的不能再用。有些混合固定劑由甲、乙兩液合并者，一定要在使用前才混合。
（6）固定完畢，根據(jù)所用固定劑的不同，用水或乙醇沖掉殘留的固定劑，以免固定劑形成沉淀，影響以后組織塊的染色。
3．脫水
生物組織中含有大量的水分，它和石蠟是不能相溶的，致使在包埋時(shí)石蠟無法滲入組織內(nèi)部，因此須使用脫水劑將水分除盡，這就是脫水的作用。
脫水劑必須能與水以任何比例相混合。脫水劑有兩類：一類是非石蠟溶劑，如乙醇、丙酮等，脫水后必須再經(jīng)過透明，才能透蠟包埋；另一類是兼石蠟溶劑，如正丁醇，脫水后即可直接透蠟。
常用的脫水劑是乙醇，因?yàn)樗鼉r(jià)格便宜，易于得到。為了避免劇烈的擴(kuò)散引起的組織的強(qiáng)烈收縮，脫水步驟應(yīng)從低到高以一定的濃度梯度來進(jìn)行，一般組織從30％乙醇開始，經(jīng)過50％、70％、80％、95％、100％至完全脫水；對(duì)于一些柔軟的組織應(yīng)從15％開始。脫水時(shí)間依據(jù)組織的類型和大小而定，一般各級(jí)乙醇中放置45min到1h，如果中間須停頓，應(yīng)使材料停留在70％乙醇中，因?yàn)榈蜐舛纫掖家资菇M織變軟、解體，高濃度乙醇有脆化組織作用，放置時(shí)間不能過長(zhǎng)，另外，脫水必須在有蓋瓶中進(jìn)行，以防止高濃度乙醇吸收空氣中水分導(dǎo)致濃度降低而使脫水不徹底。需要保存的材料可脫水至70%乙醇時(shí)停留其中，如需長(zhǎng)期保存，可加入等量的甘油。
丙酮也是很好的脫水劑，其作用和用法與乙醇相同，不過其脫水力和收縮力都比乙醇強(qiáng)。
甘油常用于藻類、菌類及柔弱材料的脫水。
二氧六環(huán)為無色的石蠟溶劑，對(duì)組織沒有收縮及硬化等不良后果，但其蒸氣有毒，使用時(shí)須小心。
正丁醇可與水及乙醇混合，亦為石蠟溶劑，其優(yōu)點(diǎn)是很少引起組織塊的收縮與變脆。
叔丁醇的性質(zhì)、作用和用法同于正丁醇，但因其價(jià)格昂貴而很少使用。
4．透明
組織塊用非石蠟溶劑脫水后必須經(jīng)過透明。透明劑能同時(shí)與脫水劑和石蠟混合，它取代了脫水劑后，石蠟便能順利地滲入組織。
透明劑的種類很多，較常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。
二甲苯作用較快，透明力強(qiáng)，但組織塊在其中停留過久，容易收縮變脆變硬，同時(shí)若脫水不凈，就會(huì)引起不良后果，在應(yīng)用時(shí)必須特別小心。通常將組織塊先經(jīng)純乙醇與二甲苯的等體積混合液，再進(jìn)入純二甲苯，這樣可減少上述的缺點(diǎn)。透明時(shí)間應(yīng)由組織大小而定，—般各級(jí)停留時(shí)間在30min至2h，在純二甲苯中應(yīng)更換2次，總時(shí)間則以不超過3h為宜。材料經(jīng)過透明，會(huì)顯示出前一步脫水的效果如何，若脫水徹底，組織則顯現(xiàn)透明狀態(tài)，如組織中有白色云霧狀，說明脫水不凈，須返工處理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明時(shí)，應(yīng)避免其揮發(fā)和吸收空氣中的水分，并保持其無水狀態(tài)。 20
甲苯的一般性質(zhì)與二甲苯相似。用法亦同，唯沸點(diǎn)較低，透明較慢，但不會(huì)使組織變脆。
苯的用法同于二甲苯，對(duì)組織的收縮作用小，但須警惕其爆炸和吸入而引起中毒。氯仿適于大塊組織的透明。
5．透蠟和包埋
包埋用的石蠟，熔點(diǎn)在50～60℃之間，應(yīng)根據(jù)材料本身的硬度、切片的厚薄和當(dāng)時(shí)的氣溫條件來選用。一般動(dòng)物材料最常用的石蠟熔點(diǎn)為52～56℃，植物材料的用54～58℃的；切片薄的用58～60℃的，切片厚的則用52～54℃的；室溫10～19℃時(shí)選用52～54℃的石蠟可順利切片，冬季可用熔點(diǎn)46～48℃的石蠟，夏季可選56～58℃的。
石蠟的優(yōu)劣與切片的成敗密切相關(guān)。鑒別石蠟質(zhì)量的方法是：將石蠟熔化后倒入紙盒使其凝結(jié)且無氣泡和裂痕，30～35℃放置24h且無氣泡和不透明的晶狀小點(diǎn)出現(xiàn)，蠟塊裂面不呈顆粒狀，切成薄片不碎成細(xì)粒。這種石蠟即為品質(zhì)優(yōu)良。含有雜質(zhì)的新蠟或用過的廢蠟可清潔后再用，方法是將石蠟放入鍋內(nèi)，加熱到開始冒白煙，然后用小火繼續(xù)加熱30min（注意別超過發(fā)火點(diǎn)），使其去除水分和揮發(fā)性雜質(zhì)，并在溫箱中過濾以去除灰塵等顆粒。
透蠟須在恒溫箱中進(jìn)行，恒溫箱的溫度調(diào)節(jié)至高于石蠟熔點(diǎn)3度，使經(jīng)過透明的組織塊依次用石蠟與二甲苯的等量混合液、純石蠟處理。純石蠟應(yīng)處理2～3次，透蠟的時(shí)間依材料性質(zhì)而定，一般每次需15～30min。
透明的關(guān)鍵是控制溫度的恒定，切忌忽高忽低，溫度過低石蠟?zāi)�固無法滲透，溫度過高使組織收縮發(fā)脆。
包埋是使浸透蠟的組織塊包裹在石蠟中。具體做法是；先準(zhǔn)備好紙盒（具體折法見圖1-3及說明），將熔蠟倒入盒內(nèi)，迅速用預(yù)溫的鑷子夾取組織塊平放在紙盒底部，切面朝下，再輕輕提起紙盒，平放在冷水中，待表面石蠟?zāi)�固后立即將紙盒按入水中，使其迅速冷卻凝固，30min后取出。
包埋用蠟的溫度應(yīng)略高于透蠟溫度，保證組織塊與周圍石蠟完全融為一體。石蠟的迅速冷卻也很重要，否則包埋塊中將會(huì)產(chǎn)生結(jié)晶。以后切片時(shí)引起碎裂。
6．切片
（1）石蠟塊的固著與整修
在包埋以后，就可進(jìn)行切片。包埋好的石蠟塊裝上泰維生物組織切片機(jī)進(jìn)行切片前還須進(jìn)行固著和整修。
固著：一般旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)上都附有可固著石蠟塊的金屬小盤，這也可用同樣大小的臺(tái)木替代。用加熱的蠟鏟將包埋塊粘貼于固著物上，并使組織塊朝外，便于以后迅速切出所需的片子。
整修：用加熱的蠟鏟或刀片將固著的包埋塊四周修平，使上下兩面修成平行面，常保留組織周圍附著寬2～3mm的石蠟，而修好的蠟塊呈長(zhǎng)方形。還可削去一角以便于在蠟帶上識(shí)別切片。
（2）切片機(jī)和切片刀
切片機(jī)是用來作各種組織切片的一種專門設(shè)計(jì)的精密機(jī)械，常用的是旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)，它的夾物部分是上下移動(dòng)前后推進(jìn)的，而夾刀部分則固定不動(dòng)。主要部件是安裝切片刀的刀臺(tái)、安裝包埋塊的標(biāo)本臺(tái)和控制切片厚度的微動(dòng)裝置。切片時(shí)切片刀固定不動(dòng)，轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)輪，標(biāo)本臺(tái)上下運(yùn)動(dòng)并按調(diào)好的切片厚度向前推進(jìn)一定的距離，組織塊上下運(yùn)動(dòng)一次，便在刀片上得到一張合乎厚度要求的切片。
切片刀與切片的質(zhì)量直接相關(guān)。切片前必須磨刀，方法是：將切片刀裝上刀柄、刀背夾、滴少許石蠟油在平滑的磨刀石上，將刀貼著磨刀石以背向刀口方向磨，使用完畢后應(yīng)及時(shí)用二甲苯將石蠟油擦凈。
（3）切片方法
切片前，將刀口置放大鏡下觀察，選擇刀口平整無缺刻的部分來進(jìn)行切削。將所要切的包埋塊固定在標(biāo)本臺(tái)上，使包埋塊外切面與標(biāo)本夾截面平行，并讓包埋塊稍露出一截。將刀臺(tái)推至外緣后松開刀片夾的螺旋，上好刀片，使切片刀平面與組織切面間呈15°左右的夾角，包埋塊上下邊與刀口平行。在微動(dòng)裝置上調(diào)節(jié)切片要求的厚度，調(diào)節(jié)時(shí)應(yīng)注意指針不可在兩個(gè)刻度之間，否則容易損傷切片機(jī)，將刀臺(tái)移至近標(biāo)本臺(tái)處，讓刀口與組織切面稍稍接觸，這時(shí)就可以開始切片了。方法是：右手轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)輪，左手持毛筆在刀口稍下端接隹切好的片子，并托住切下的蠟帶，待蠟帶形成一定長(zhǎng)度后，右手停止轉(zhuǎn)動(dòng)，持另一枝毛筆輕輕將蠟帶挑起，平放于襯有黑紙的紙盒內(nèi)，注意切片速度不宜太快，搖動(dòng)轉(zhuǎn)輪用力應(yīng)均勻，防止切片機(jī)震動(dòng)厲害引起切片厚薄不均勻，還應(yīng)注意轉(zhuǎn)動(dòng)的方向，以防標(biāo)本臺(tái)后移而切不到片子。切片完畢，應(yīng)及時(shí)用氯仿將切片機(jī)的有關(guān)部分擦凈。
（4）切片中存在的問題及補(bǔ)救方法
石蠟切片是很不容易掌握的，有時(shí)很容易成功，有時(shí)則由于某種因素而造成切片的質(zhì)量低劣，甚至完全失敗�，F(xiàn)將切片時(shí)經(jīng)常遇到的一些缺點(diǎn)、可能的原因以及補(bǔ)救辦法列于表1-3。



7．貼片
切好的切片必須貼附于載玻片上才能作進(jìn)一步處理，但是切片常有細(xì)小的橫紋，必須經(jīng)展平后才能貼附，否則影響染色和觀察。
貼片一般有撈片法和燙板法。
撈片法比較簡(jiǎn)單，首先將切片分割開，投入到48℃的溫水浴中，這時(shí)切片都浮在水面上，由于表面張力的作用使切片自然展平，然后用涂有甘油蛋白溶液（將雞蛋一個(gè)打破入杯中，去除蛋黃留下蛋白，用筷子充分調(diào)打成雪花狀泡沫，然后用雙層紗布過濾至容器中，加入等量的甘油，混合，最后加入百分之一體積的麝香草酚（thymol）作防腐用，可保存幾個(gè)月到一年。）或5％明膠水溶液的載玻片傾斜著插入水面去撈取切片，使切片貼附在載玻片的合適位置，于室溫下放置一晝夜后使其徹底干燥。
燙板法，是將涂有粘片劑的載玻片上涂上水，把已分割好的切片貼上去，再置載玻片于35℃恒定的燙板上讓切片攤干，并傾斜或用吸水紙吸去水分，最后將載玻片再度放燙板上晾干。
要注意，不管是使用撈片法還是燙板法，所用的載玻片必須潔凈，不能有油污（檢驗(yàn)法：已涂有粘片劑的載玻片上滴加數(shù)滴蒸餾水，若發(fā)現(xiàn)水不均勻分散而聚成滴狀，即表示載玻片不清潔，有殘留油脂等物在上面）；切片的光面應(yīng)朝下，否則染色過程中切片容易脫落。
8．染色
組織切片是無色透明的，必須進(jìn)行染色后才能觀察到各種微細(xì)結(jié)構(gòu)。染色方法很多，但是染色劑往往是水溶液，因此切片必須經(jīng)過脫蠟而再度復(fù)水。這方法即為脫水、透明的逆過程。由于切片十分菲薄，處理的時(shí)間大大減少，一般每級(jí)停留約2～5min。
染色是一個(gè)復(fù)雜的過程，兼有物理和化學(xué)作用，對(duì)其中的機(jī)制目前了解得不很清楚。研究細(xì)胞器和細(xì)胞內(nèi)的重要組分都有很多現(xiàn)成的方法，例如顯示DNA的Feulgen反應(yīng)，顯示RNA的Brachet反應(yīng)，顯示多糖的PAS反應(yīng)，顯示蛋白質(zhì)的Millon反應(yīng)和顯示某些酶的鈣—鈷法等，可以根據(jù)不同的要求來選用。
9．透明
染色后的切片須再次經(jīng)過脫水、透明。標(biāo)本經(jīng)二甲苯透明后，折射率改變，透明度提高，使得染上色的部位更清晰地顯示出來。
10．封藏
封藏的目的是使制成的切片能夠永久保存，封藏劑必須能與透明劑互溶，對(duì)染色無影響，折射率近似玻璃和具有粘性的物質(zhì)，常用的封藏劑有加拿大樹膠和中性樹膠。
封片的方法是：將載玻片從二甲苯中吸出后，吸去多余的二甲苯，在標(biāo)本上的二甲苯尚未干透之前加一滴樹膠，仔細(xì)覆蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡，也不得拖動(dòng)蓋玻片，以免將標(biāo)本破壞。樹膠量視蓋玻片大小而定，勿使過多過少。
貼上標(biāo)簽，注明材料、染色法，待封藏劑凝固后便成為一張成功的石蠟切片。

石蠟切片基本步驟之一 器材和試劑

一、準(zhǔn)備工作（一）
（一）洗滌實(shí)驗(yàn)所需器皿：（玻璃器皿的清洗） 
1、 用洗衣粉將玻璃器皿表里擦洗干凈反復(fù)洗刷 
2、 將器皿在自來水下沖洗干凈 
3、 將器皿倒扣在鋪有吸水紙或紗布的桌子上控干 
注：一般情況下，經(jīng)以上步驟后，用蒸餾水洗過1~3次即可烘干備用，如果做特殊染色還需浸泡在酸性清潔液內(nèi)12~24小時(shí)，再經(jīng)自來水徹底沖洗，再用蒸餾水過洗1~3次 烘干備用。 
（二）配制： 硫酸洗液的配制 
（三）載玻片與蓋玻片的處理 
1. 將所需載玻片與蓋玻片清洗后，放入硫酸重鉻酸鉀溶液中浸泡24小時(shí) 
2. 流水沖洗，再用蒸餾水沖洗3遍 
3. 95%~100%酒精浸泡24小時(shí)，用綢布擦干備用 
注：在將載玻片與蓋玻片放入清潔液中時(shí)，要一片片地投入，使其不致重疊。
二、準(zhǔn)備工作（二）常用液體的配制 
（一）緩沖溶液： 
1．磷酸鹽緩沖液 
A液：0.1mol/L磷酸二氫鈉 
B液：0.1mol/L磷酸氫二鈉 
A液與B液按比例混合調(diào)整到所需的PH值（3：7≈PH7.0） 
2．枸椽酸緩沖溶液 
A液：0.1mol/L枸椽酸 
B液：0.1mol/L枸椽酸鈉 
A液與B液按比例混合調(diào)整到所需的PH值（6.2：42.8≈PH6.2） 
（二）固定劑： 
1．甲醛：10%甲醛
福爾馬林 100ml
蒸餾水 900ml 
注：實(shí)際甲醛含量只有3.6~4.0%但習(xí)慣上都將其視為10%。 
2．10％中性福爾馬林鈣固定液 
甲醛液 10ml 
蒸餾水 90ml 
加碳酸鈣至過飽和(以容器底部碳酸鈣沉淀1~2cm厚為適度)充分振蕩混合后，放置24小時(shí)取上清液使用。 
3．4%多聚甲醛： 
8%多聚甲醛
多聚甲醛 8g 
蒸餾水 100ml 
加溫至60℃左右，不時(shí)攪拌，成為乳白色溶液。滴加1N NaOH，并不停攪動(dòng)至液體清明。 
1N NaOH 
lN等于1L溶液中某種物質(zhì)1mol除以該物質(zhì)的氫當(dāng)量?jī)r(jià)所得數(shù)值的量 
氧化鈉(NaOH )；分子量＝40．005，當(dāng)量?jī)r(jià)＝1 
1N Na0H的配制方法為：m＝40．005／1＝40．005g。取40．005gNaOH溶解于1L蒸餾水中
4%多聚甲醛 
8%多聚甲醛 50ml 
0.1M磷酸鹽緩沖液 50ml 
PH7.2 
先取50 ml 8%多聚甲醛，用0.1M磷酸二氫鈉和0.1M磷酸氫二鈉將PH值調(diào)至7.2
4．Bouin液： 
苦味酸飽和水溶液 75ml 
36％~40％福爾馬林液 25ml 
冰醋酸 5m1 
5．改良Bouin氏固定液
苦味酸飽和水溶液 45ml 
95%酒精 45ml 
36％~40％福爾馬林液 5ml 
冰醋酸 5m1
6．Carnoy液： 
冰醋酸 10 m1 
氯仿 30 m1 
無水乙醇 60 m1 
以上三者臨用前混合，預(yù)冷至4℃后使用。24小時(shí)后固定液失效。 
（三）染色液 
1．Harris蘇木精液 
A液： 
蘇木精 1g 
無水酒精 10ml 
B液： 
銨礬或鉀礬 20g 
蒸餾水 200ml 
氧化汞 0.5ml 
冰醋酸 8ml 
將礬溶于水，加熱溶解（B液），稍冷后將蘇木精酒精液（A液）混入B液，加熱，稍冷卻，加氧化汞，再繼續(xù)加熱1分鐘，染液變?yōu)樽仙�，注意在加氧化汞時(shí)宜逐漸少量加入，防止染液濺出。全冷后呈深紫色，將燒杯口用紗布蓋好，隔夜過濾，在過濾液內(nèi)每96 ml中加4 ml冰醋酸，放置1周后成熟，即可用于染色，保存期1~2個(gè)月。此染液在加醋酸后，對(duì)核染色特具選擇性，故很適于脫落細(xì)胞的核染色。由于染液內(nèi)已加有氧化劑，故不能長(zhǎng)期儲(chǔ)存，但利于配后即用。 
2．Mayer蘇木精掖 
蘇木精 1g 
鉀礬或銨礬 50g 
碘酸鈉 0.2g 
蒸餾水 1000ml 
水合氯醛 50g 
枸櫞酸 1g 
將蘇木精，鉀礬及碘酸鈉依次加入水內(nèi)，略加熱并攪拌，此時(shí)液體呈藍(lán)色，待全溶后過夜。再加入水合氯醛及枸櫞酸并加熱至煮沸5分鐘，冷后過濾備用。如不急用可不煮沸而在室溫待其成熟，染液可較長(zhǎng)期貯存使用。核染色鮮明，染色時(shí)間5—10分鐘。用該染液染色后，不需分化，充分水洗藍(lán)化后即可，伊紅復(fù)染細(xì)胞質(zhì)，使用一段時(shí)間后就要換新溶液。 
3．Hasnsen甲礬蘇木精的配制 
A液：蘇木精 1g 
無水乙醇 10ml 
B液：鉀礬 20g 
蒸餾水 200ml 
C液：高錳酸鉀 1g 
蒸餾水 16ml 
三液分別溶化后，將A液倒入B液，再加入C液3ml，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝蠹訜嶂练序v，1分鐘左右，將容器置于冷水中使其迅速冷卻，此液配后即可使用，染后無需堿化，細(xì)胞核即為藍(lán)色，效果較好，高錳酸鉀可以迅速氧化蘇木精（每1g蘇木精需0.177g高錳酸鉀氧化）。 
4．伊紅 
0.5~1%水溶液或酒精溶液。 
1．水溶性伊紅 
伊紅 5~10g 
蒸餾水 1000ml 
冰醋酸 10滴 
先將水溶性伊紅加入蒸餾水中，用玻璃棒攪起泡沫后過濾，再加冰醋酸。 
2．醇溶性伊紅 
伊紅 5~10g 
70%~90%酒精 1000ml 
冰醋酸 10滴 
（四）其它 
1．麻醉劑： 
2~4%戊巴比妥鈉，1ml/kg體重（45mg/kg）。 
2．各級(jí)濃度酒精的配制 
75%；85%；95%；100%酒精。75%和85%酒精用95%酒精配制；（取75ml95%酒精，加水至95ml，即為75%酒精） 
3．鹽酸灑精 
多用于多種染色過程中的分色，如蘇木精染色后分色。配法是在100ml的70％酒精內(nèi)加0.5~1ml的濃鹽酸(Hcl)。用鹽酸酒精分色后要經(jīng)自來水充分沖洗組織切片，去除所含的酸再作其他處理。 
4．碘酒 
取碘5g，溶于95％酒精80ml，再加入20ml蒸溜水即成 
5．生理鹽水 
以氯化納0.85~0.90g溶于100m1蒸餾水配成的生理鹽水適用哺乳動(dòng)物

石蠟切片基本步驟之二 取材 固定

三、取材，固定
（一） 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的抓取及固定 
1．小白鼠、大白鼠的抓取及固定方法 
要點(diǎn)：（1）動(dòng)作要輕緩；（2）不要突然襲擊；（3）如發(fā)現(xiàn)動(dòng)物的毛發(fā)豎起來時(shí)，最好停一會(huì)后再抓；（4）將四肢打開，固定在木板或方形蠟板上。 
2．實(shí)驗(yàn)家兔的抓取及固定方法 
要點(diǎn)：（1）隨時(shí)撫摩其頭部；（2）防止被其腳爪抓傷；（3）根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇固定方法。 
3．豚鼠的抓取及固定方法 
要點(diǎn)：先用一只手扣住豚鼠背部，然后抓緊兩耳間頭頸部的皮膚，用另一只手托起臀部送到動(dòng)物固定臺(tái)上。 
（二） 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的編號(hào)、標(biāo)記、分組和被毛去除方法 
1．編號(hào)和標(biāo)記方法 
（1）染色法 
標(biāo)記溶液：3%~5%苦味酸 黃色 
2%硝酸銀 咖啡色（涂后光照10分鐘） 
0.5%中性紅或品紅 紅色 
龍膽紫 紫色 
編號(hào)原則：先左后右，從前到后 
左前腳為1，左側(cè)腹為2，左后腿為3，頭頂為4，腰背部為5，尾基為6，右前腳為7，右側(cè)腹為8，右后腿為9。超過10可用不同的染色的標(biāo)記液，一種染色為個(gè)位，另一種為十位數(shù)。 
（2）掛牌法 
（3）耳孔法 
一般來說，小型動(dòng)物適宜用耳孔法和染色法，中型動(dòng)物適用于掛牌法。 
2．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的隨機(jī)分組方法 
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，常常需要將選擇好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，按研究需要分成若干個(gè)組，分組時(shí)為了避免人為因素的影響，常應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行完全隨機(jī)化的分組。 
3．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被毛去除方法 
剪毛法 
拔毛法 
剃毛法 
脫毛法：系用化學(xué)脫毛劑將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被毛脫去，適用于無菌手術(shù)野的準(zhǔn)備以及觀察動(dòng)物皮膚血液循環(huán)和病理變化。方法：將需脫毛部位的被毛先用彎頭剪刀剪去，盡量剪短，勿剪破皮膚。然后用溫水將該部位潤(rùn)濕，再用紗布包扎棉球的小棒蘸脫毛劑，在需脫毛部位涂一層，經(jīng)2~3min后，用溫水洗去該部位脫下的毛，自然晾干備用，切勿用紗布去擦，以免損傷皮膚。 
脫毛劑配方： 
（1）硫化鈉3g 
肥皂粉1g 
淀粉7 g 
加水適量調(diào)成糊狀 
（2）硫化鈉8g 
溶于100ml水中 
（3）硫化鈉8g 
淀粉7 g 
糖4 g 
甘油5 g 
硼砂1 g 
加水75ml 
（三） 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死 
處死動(dòng)物的方法很多，無論是采用哪種方法，都要盡力避免使動(dòng)物長(zhǎng)時(shí)間陷于痛苦和瀕于死亡狀態(tài)。熱愛生命，珍愛動(dòng)物。 
1．空氣栓塞致死法 
要點(diǎn)：（1）常用于大的動(dòng)物（如：兔、貓、狗和猴等）；（2）用50~100ml注射器一只；（3）此方法迅速、方便，但各臟器淤血明顯。 
2．麻醉后處死法 
注：采用此方法，取材后一定要確定動(dòng)物是否已死亡，最好再行斷頸。 
（1）吸入麻醉法
要點(diǎn)：（1）適用于較小的動(dòng)物（小白鼠、大白鼠、豚鼠和兔等）；（2）用乙醚浸泡過的脫脂棉；（3）時(shí)間大約1~2分鐘；（4）注意防火 
（2）注射麻醉法
要點(diǎn)：（1）適用范圍較廣；（2）注射方式可采用靜脈、腹腔、皮下和肌內(nèi)注射，最常用的是腹腔注射；（3）注射致死量一般視動(dòng)物大小而定。 
3．腦、脊破壞法 
要點(diǎn)：（1）常用于蛙類；（2）用金屬針經(jīng)枕骨大孔進(jìn)入，破壞大腦和脊髓。 
4．?dāng)囝^處死法 
要點(diǎn)：（1）常用于小動(dòng)物；（2）用剪刀剪斷頸椎；（3）如果沒有特殊要求，最好不要使頭和軀干分離。 
5．?dāng)嘧捣?nbsp;
要點(diǎn)：（1）常用于大白鼠和小白鼠；（2）一手固定頭部，一手拽住實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的尾部，輕輕一拉扯斷其頸椎，使其脫位，椎管內(nèi)急性損傷癱瘓或死亡后取材；（3）此方法處死動(dòng)物組織結(jié)構(gòu)保存較好。 
（四） 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物解剖 
解剖步驟 
1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被麻醉或處死后，將其；固定在動(dòng)物解剖臺(tái)上，用紗布蘸取生理鹽水濕潤(rùn)被毛； 
2．從下頜至恥骨聯(lián)合沿正中線切開皮膚； 
3．打開腹腔：沿肋骨下緣腹正中，用鑷子提起腹壁切開腹壁肌肉，至恥骨聯(lián)合，從肋骨下端向脊柱方向，將兩側(cè)腹壁剪開，充分暴露腹腔內(nèi)臟器； 
4．打開胸腔：用剪刀沿肋骨的肋軟骨和骨的連接處由下向上剪開，不要剪斷鎖骨，剪時(shí)應(yīng)盡量貼著胸內(nèi)壁，并注意不要剪斷胸骨兩側(cè)的大血管。然后將肋弓提起，暴露腹腔內(nèi)臟器。 
（五） 取材
取材一定要迅速，應(yīng)在動(dòng)物處死后立即進(jìn)行解剖和切取組織材料，否則會(huì)引起細(xì)胞發(fā)生死后變化（如組織自溶及腐敗現(xiàn)象等），進(jìn)而失去原有的結(jié)構(gòu)，如果進(jìn)行酶組化染色，將會(huì)使大量的酶失活和丟失。
取材方法和注意事項(xiàng) 
（1）取材用的刀剪必須鋒利，取材時(shí)應(yīng)用鑷子夾該組織的周圍的結(jié)締組織，凡是用鑷子夾過的或用手壓過的組織均不可用。 
（2）根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇不同的取材方法（整體取出臟器法、單個(gè)臟器取出法和切取組織塊法等） 
（3）取材的先后順序原則。根據(jù)死后組織結(jié)構(gòu)改變的速度的快慢而定。先腹腔后胸腔，先消化管后肝、脾等多血的器官及神經(jīng)組織。 
（4）取材組織塊的大小既要保證組織的完整性，又要力求小而薄，一般以1.0cm×1.0cm×0.5cm為好，但有些特殊要求的可視情況而定。 
（5）較小的組織或器官（淋巴結(jié)、松果體、腦垂體和神經(jīng)節(jié)等）應(yīng)整體固定，但要破壞其表面一側(cè)的被膜。 
（6）管狀及囊狀組織（消化管的取材）都不應(yīng)斜切，先將一段腸管或食管剪下，從中剪開管腔，使之成片狀，然后將其鋪在紙板下，黏膜面朝上，用大頭針或細(xì)線將四邊固定，用生理鹽水漂洗黏膜表面，然后固定。 
（7）較細(xì)的管狀臟器（輸尿管、輸精管、輸卵管、中動(dòng)脈和靜脈等）應(yīng)取下1~2cm長(zhǎng)，平鋪于硬紙片上或吸水紙上分段固定。 
（8）取材要盡量注意臟器的完整性。 
（9）應(yīng)根據(jù)所要觀察的部位及實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行選擇組織的切面。對(duì)于病理材料，除切取病變部位外，還要切取病變和正常組織交界部分的區(qū)域，以利于進(jìn)行正常組織與病理組織的對(duì)比觀察分析。 
（10）取材時(shí)要注明取材時(shí)間、組織器官名稱、固定液名稱、組織塊的數(shù)量、所取組織位于器官的部位等，以備查。 
（六） 固定
1．固定的目的
（1）防止組織溶解及腐敗，以保持組織和細(xì)胞與正常生活時(shí)的形態(tài)相似；
（2）使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪、糖、酶等各種成分轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以保持它原有的結(jié)構(gòu)與生活時(shí)的相仿；
（3）組織細(xì)胞內(nèi)的不同物質(zhì)經(jīng)固定后可以產(chǎn)生不同的折光率，對(duì)染料也產(chǎn)生不同的親和力，造成光學(xué)上的差異，使得在生活情況下原來看不清楚的結(jié)構(gòu)變得清晰起來，并使得細(xì)胞各部分容易著色，有利于區(qū)別不同的組織成分。
（4）固定劑的硬化作用，增加組織硬度，便于制片。
2．固定的對(duì)象和方法
（1）固定的主要對(duì)象是蛋白質(zhì)；
（2）固定液的量要足夠，其固定液的量一般不少于組織總體積的10倍以上（一般為1：20）。對(duì)于某些需要制作神經(jīng)染色和酶組織化學(xué)染色的組織固定，比一般的固定要嚴(yán)格。
（3）特殊的固定方法（注射或灌注固定）：某些組織塊由于體積過大或固定液極難滲入內(nèi)部或需要對(duì)整個(gè)臟器或整個(gè)動(dòng)物進(jìn)行固定，宜采用此方法，將固定液注入血管，經(jīng)血管分支到整個(gè)組織和全身，從而得到充分固定。
①局部灌注固定：
肺：肺內(nèi)含有空氣，固定難以滲入，可將固定液從氣管、支氣管或肺動(dòng)脈注入固定液，從支氣管注入時(shí)速度一定要慢，量不宜過多。注射固定后可將整個(gè)肺投入固定液中6~12小時(shí)，再分別切成小塊。
肝、腎：經(jīng)肝動(dòng)脈或腎動(dòng)脈注入固定液。
腦：動(dòng)物麻醉后暴露頸動(dòng)脈，以注射針尖向著關(guān)部的方向注入固定液。
②全身灌注固定：
步驟：取大白鼠，1%戊巴比妥鈉麻醉，打開胸、腹腔，縱向切開心包，用紗線在主動(dòng)脈弓起始部，然后用50ml注射器，選用適當(dāng)針頭，從左心室向主動(dòng)脈方向刺入，將紗線扎緊固定，在右心房開一孔放血，取用與動(dòng)物等量的生理鹽水注入血管中洗滌，待洗滌處的液體不見血時(shí)，再注入固定液。待動(dòng)物體有一定硬度時(shí)即可取材，將所需組織從動(dòng)物身上切去后，經(jīng)適當(dāng)處理，即投入固定液中（甲醛或多聚甲醛）
3．固定液的性質(zhì)和條件
（1）能迅速滲入組織，使組織細(xì)胞形態(tài)在短期內(nèi)不至于有較大變化。
（2）固定液有相當(dāng)?shù)臐B透力，對(duì)組織各部分的滲透力相等，可使組織內(nèi)外完全固定。
（3）使組織細(xì)胞不至于因固定而引起人為的改變。
（4）盡可能避免固定劑使組織膨脹或收縮。
（5）使組織達(dá)到一定硬度，獲得較佳的折光率和對(duì)染料具有較強(qiáng)的親合力。
4．固定時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)
（1）固定液及被固定的組織必須新鮮；
（2）固定液的用量一般為組織體積的10~20倍，容器不要過小，材料也不要太多；應(yīng)避免組織緊貼瓶底或瓶壁，以免影響固定液的滲入，必要的時(shí)候可以在瓶底墊上一層棉花；
（3）固定時(shí)間視組織塊的種類、性質(zhì)、大小，固定液的種類、性質(zhì)、滲透力的強(qiáng)弱，固定時(shí)的溫度的高低，實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡龋?/span>
（4）防止被固定的組織因固定劑的作用而發(fā)生變形；
（5）固定所用的固定液，以新配的為好，放置過久會(huì)失效；
（6）在固定期間搖動(dòng)組織或搖動(dòng)容器有利于固定液的滲入，對(duì)長(zhǎng)期固定的標(biāo)本，可經(jīng)常更換固定液
（7）取材固定應(yīng)同時(shí)作好記錄，包括組織名稱、固定液和時(shí)間等內(nèi)容。
5．固定劑
單純固定劑
（1）10%甲醛：對(duì)組織滲透性強(qiáng)，固定均勻。對(duì)組織膨脹約5%，經(jīng)酒精脫水時(shí)有較大的收縮。能保存脂肪，不能沉淀核蛋白及白蛋白，長(zhǎng)期用其固定的組織使組織變?yōu)樗嵝裕�不利于染色，特別是細(xì)胞核的著色。經(jīng)自來水沖洗6~24小時(shí)后，可以使其酸堿中和，并減少結(jié)晶。
（2）4%多聚甲醛：對(duì)組織穿透性好，組織收縮小，對(duì)大多數(shù)抗原物質(zhì)保存較好，特別是對(duì)脂肪和各種酶的固定效果更好。固定的時(shí)間不宜太長(zhǎng)，以24小時(shí)以內(nèi)為宜，適用于免疫組織化學(xué)染色。
（3）飽和的苦味酸溶液：能沉淀一切蛋白質(zhì)，滲透力弱，對(duì)組織收縮大，故一般不能單獨(dú)使用。
（4）冰醋酸：滲透力強(qiáng)，沉淀核蛋白，對(duì)染色質(zhì)固定好，使組織膨脹，故一般不單獨(dú)使用。
（5）鋨酸：價(jià)格昂貴，為強(qiáng)氧化劑，易還原成氫氧化鋨，呈黑色沉淀；必須避光保存。不能沉淀蛋白質(zhì)，而使蛋白質(zhì)凝膠化，所以對(duì)蛋白質(zhì)固定不均勻，鋨酸固定的細(xì)胞能保持生活時(shí)的形態(tài)，不收縮細(xì)胞，對(duì)胞質(zhì)固定較長(zhǎng)好，核的固定不好，鋨酸為脂肪及類脂質(zhì)的優(yōu)良固定劑，經(jīng)它固定的脂肪和類脂質(zhì)呈黑色，特別是對(duì)于是顯示線粒體和高難度爾基復(fù)合體效果良好。
混合固定劑
（1）Bouin氏固定液：為常用的良好的固定劑，穿透速度快，組織收縮性較小，固定均勻，固定后組織有適當(dāng)?shù)挠捕�，�?duì)于切片和染色均有良好的效果。一般固定12~24小時(shí)，固定后入70%酒精洗去苦味酸的黃色，在脫水時(shí)經(jīng)各濃度酒精也可洗去黃色，在酒精中加入氨水一滴或少許碳酸鉀飽和水溶液，可加快洗去苦味酸的黃色即使留有少量苦味酸的黃色，對(duì)一般染色體并無影響。
（2）Zenker液（PH2.3）：此液多用于一般組織的固定，它能使細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)染色清晰但固定時(shí)間長(zhǎng)，一般要12~36小時(shí)，加熱可以縮短固定時(shí)間。固定后的組織必須流水沖洗12小時(shí)，由于固定中含有升汞，在經(jīng)70%酒精脫水時(shí)，加少量的碘液（0.5%碘酒精）以脫汞。
（3）Carnoy液：滲透力強(qiáng)，特別適宜于固定染色體、肝糖、粘液等一些較為細(xì)微的結(jié)構(gòu)。顯示DNA、RNA效果良好。
（4）改良Bouin氏固定液：此液對(duì)一般組織固定效果都很好，固定時(shí)間為4~18小時(shí)，固定后直接放70%乙醇脫水，固定時(shí)間較長(zhǎng)對(duì)組織亦無損害。
（七） 組織塊修整 
固定后的組織塊可能會(huì)在外部形態(tài)上有些改變，或者由于組織在還未固定時(shí)就取材，組織器官較軟，取材不容易切平。經(jīng)固定后的組織有一定的硬度，此時(shí)就可以做一些修整，但改變不要太大，只是將組織材料切取平整，修掉一些不規(guī)則的部位。修整組織塊時(shí)，手術(shù)切片一定要鋒利。

石蠟切片基本步驟之三 水洗，脫水，透明，浸蠟包埋

四、水洗
1．目的： 
洗去滲入組織中的固定液，終止固定。以免影響對(duì)組織內(nèi)結(jié)構(gòu)的觀察、分析和研究。 
2．原則和方法： 
固定后的組織塊的沖洗，一般情況下是置水龍頭下以自來水流水沖洗，這樣可以使組織中的固定液隨時(shí)溢出，洗得更干凈徹底，有些還需要進(jìn)行特殊的洗滌。 
（1）各種以水配制的固定液如甲醛，都必須用流水沖洗，大塊組織一般沖洗24小時(shí)，小塊組織一般沖洗2—10小時(shí)。 
（2）固定液為多聚甲醛時(shí)，用于免疫組織化學(xué)等特殊染色的應(yīng)將組織投入PB緩沖液中，每60分鐘更新洗滌液一次，累計(jì)6小時(shí)。 
（3）固定液為酒精或是酒精混合液，一般不需用水沖洗，其組織塊的洗滌應(yīng)用與固定液濃度相等垢酒精換洗或者直接進(jìn)行脫水的程序。 
（4）用鋨酸或含有鋨酸的固定液固定的組織，必須用流水徹底沖洗干凈。 
（5）經(jīng)含有苦味酸的固定液固定的組織塊，無論其固定液是水溶性還是酒精溶性，都應(yīng)充分沖洗，水溶性固定液固定的組織塊一般須沖洗12小時(shí)，再進(jìn)入70%的酒精溶液洗滌，酒精溶性固定液固定的組織塊直接進(jìn)入70%的酒精溶液洗滌，該溶液可以脫掉苦味酸的黃色，但最好從50%酒精開始洗滌。 
（6）沖洗好的組織可存放在75%酒精內(nèi)
五、脫水包埋
（一）脫水 
1．脫水的目的 
組織內(nèi)的水不能和支持劑混合，所以必須把組織中的水分徹底脫除。脫水有利于組織的透明和浸蠟，有利于組織的永久保存。 
2．脫水劑 
（1）乙醇：可作固定劑，又可脫水劑，但乙醇與水混合時(shí)有較劇烈的物理反應(yīng)。高濃度的酒精對(duì)組織有強(qiáng)烈收縮及脆化的缺點(diǎn)，因此用乙醇脫水不能直接入純酒精中脫水，而必須經(jīng)過由高到低的一系列不同濃度的酒精，逐漸取代組織中水分，以保證組織脫水徹底，并避免組織過度收縮和硬化。 
（2）丙酮：脫水能力比酒精強(qiáng)，但對(duì)組織的收縮更大，在組織學(xué)制片中較少使用，多用于病理快速切片，或用于某些組化水解酶的固定。 
（3）正丁醇：是較好的脫水兼透明劑，可與酒精及石蠟混合，用于脫水是可先經(jīng)過各種不同濃度的正丁醇和乙醇混合液，再入正丁醇，進(jìn)行石蠟包埋時(shí)，可先用正丁醇和石蠟等量混合液，然后浸入純石蠟包埋，正丁醇用于脫水的優(yōu)點(diǎn)是很少引起組織收縮和脆硬，可替代二甲苯，是很好的脫水劑，但由于價(jià)格較貴，不常使用。 
3．步驟 
（1）乙醇脫水過程 
50%乙醇 6~8小時(shí) 
75%乙醇 6~8小時(shí) 
85%乙醇 3~5小時(shí) 
95%乙醇 1~2小時(shí) 
95%乙醇 1~2小時(shí) 
100%乙醇Ⅰ 1小時(shí) 
100%乙醇Ⅱ 1小時(shí) 
（2）丙酮脫水 
如果是丙酮固定的組織，則不必再經(jīng)過乙醇，可以用新丙酮更換一次，便直接浸入二甲苯或苯中透明。其他水溶液固定的組織，均按上述乙醇脫水方法脫水，亦可由100%乙醇中移入丙酮繼續(xù)脫水2~4小時(shí)再入二甲苯透明，透明后浸蠟包埋。 
（3）正丁醇脫水 
組織用正丁醇脫水前，先經(jīng)50%乙醇脫水，然后移入正丁醇和乙醇混合液進(jìn)行脫水。 
50%乙醇 6~12小時(shí) 
50%乙醇+20%正丁醇+30%蒸餾水 5~8小時(shí) 
50%乙醇+35%正丁醇+15%蒸餾水 4~6小時(shí) 
45%乙醇+45%正丁醇+10%蒸餾水 3~5小時(shí) 
25%乙醇+75%正丁醇 2~3小時(shí) 
25%乙醇+75%正丁醇 1~2小時(shí) 
15%乙醇+85%正丁醇 1~2小時(shí) 
5%乙醇+95%正丁醇 1~2小時(shí) 
100%正丁醇Ⅰ 1小時(shí) 
100%正丁醇Ⅱ 1小時(shí) 
4．注意事項(xiàng)： 
（1）脫水的過程應(yīng)逐步地而不應(yīng)驟然地進(jìn)行，不能操之過急。 
（2）脫水的時(shí)間應(yīng)根據(jù)組織塊的大小和組織的類型而定。 
（3）組織塊在高濃度，特別是無水乙醇內(nèi)不能放置的時(shí)間太長(zhǎng)。無水乙醇吸水能力太強(qiáng)，容易造成組織塊的過度硬化，使得切片理組織易碎裂。 
（4）在脫水的過程中可以將組織塊停留在70%~80%的酒精中。 
（5）每次更換新的脫水劑時(shí)（組織塊從低濃度到高濃度），都要把組織塊放在吸水紙上吸干，裝組織塊的容器也要控干水分，以免將水及低濃度脫水劑帶入高濃度脫水劑中，影響脫水效果。 
（6）脫水劑的先擇要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求及實(shí)驗(yàn)室的條件 
（二）透明 
1．透明的目的 
置換組織內(nèi)的脫水劑，為下一步的浸蠟起到橋梁作用； 
使組織呈現(xiàn)不同程度的透明狀態(tài)，有利于光線的透過。 
2．透明劑 
（1）二甲苯：是現(xiàn)在應(yīng)用最廣的一種透明劑，價(jià)格較便宜，不能和水混合，遇水則變成乳白色渾濁，因此必完全脫水后才能使用；易溶于酒精又能溶解石蠟，透明力強(qiáng)；其最大的缺點(diǎn)是容易使組織收縮變硬變脆，所以組織不能在其停留過久，透明時(shí)間視組織塊的大小、性質(zhì)而定；有的組織如肌肉、肌腱、軟骨、骨、皮膚、頭皮及眼球等，不宜用二甲苯透明，因組織過硬不易切片；長(zhǎng)時(shí)間接觸，對(duì)粘膜有刺激作用。 
（2）苯：性質(zhì)與二甲苯相似，對(duì)組織收縮也較小，組織也不易變脆，但透明較慢，組織在其內(nèi)可以滯留12~24小時(shí)，但毒性較大。 
（3）香柏油：用為透明劑，效果很好，有高度透明作用，能與醇和二甲苯混合，香柏油對(duì)組織的硬化及收縮程度比任何其他透明劑都要小，但透明的速度較慢，3mm以下厚度的組織塊需12小時(shí)以上。香柏油與石蠟不易融合，即香柏油不易被石蠟取代，因此經(jīng)香柏油透明以后，可經(jīng)過二甲苯短時(shí)間媒浸，再進(jìn)行石蠟包埋。肌肉、皮膚、血管、膀胱、垂體及腎上腺等用香柏油效果較好。
3．二甲苯的步驟：兩次透明 
第一次透明約40分鐘 
第二次時(shí)間不一定，要視透明效果而定 
4．注意事項(xiàng) 
（1）時(shí)間不宜過長(zhǎng)，否則組織會(huì)變脆； 
（2）組織塊脫水必徹底。 
（三）浸蠟、包埋（石蠟包埋法） 
1．浸蠟 
（1）浸蠟的目的 
置換組織中的透明劑，為包埋做準(zhǔn)備。 
（2）浸蠟的步驟 
在60度恒溫蠟箱中放置3個(gè)蠟杯，分別編號(hào)1（52℃~54℃）、2（52℃~54℃，或54℃~56℃）、3（56℃~58℃），其中分別盛軟蠟、軟蠟、硬蠟，取透明好的組織塊放入軟蠟中各1小時(shí)，迅速取出放入硬蠟，同樣放置1小時(shí)。如果時(shí)間來及包埋，可以將已經(jīng)完成浸蠟的組織塊取出放在溫箱外，第二天繼續(xù)。 
（3）注意事項(xiàng) 
溫箱中的溫度必須嚴(yán)格控制在60℃的范圍，不能超過60℃；浸蠟時(shí)間不宜過長(zhǎng)。浸蠟溫度過高或時(shí)間過長(zhǎng)使組織收縮過度收縮和脆變。 
2．包埋
（1）步驟 
①準(zhǔn)備包埋蠟：一般應(yīng)用硬蠟（56~58℃或60~62℃）為好，所用的石蠟要求透明無雜質(zhì)，新的石蠟要反復(fù)熔凝，并有一定的粘韌性，可以加一些蜂蠟。蠟的熔點(diǎn)應(yīng)與組織的硬度相適應(yīng)。包埋用過的石蠟可以反復(fù)使用。 
②準(zhǔn)備包埋框：可以用金屬的，也可以用硬紙摺疊。 
③點(diǎn)燃酒精燈，準(zhǔn)備好無齒尖鑷子，需作標(biāo)記應(yīng)先寫好標(biāo)簽。 
④在金屬框中倒入硬蠟，然后用無齒鑷子取組織塊放入石蠟中，置好方向�？墒覝叵吕鋮s。 
⑤包埋框或紙盒內(nèi)的蠟逐漸凝結(jié)，若表面已凝結(jié)形成一層固體狀，即可放入冷水中，加速其凝固。 
⑥待蠟塊完全凝固以后，便可拆卸包埋框架， 或拆開紙盒，取出蠟塊。 
（2）注意事項(xiàng) 
①包埋時(shí)夾取組織的鑷子，用酒精燈隨時(shí)燒熱，以免石蠟?zāi)�結(jié)后粘附在鑷子上，造成蠟塊凝固不均勻。 
②包埋操作要迅速，組織從浸蠟杯中取出置入包埋框中的時(shí)間應(yīng)盡量縮短。 
③包埋后的蠟塊應(yīng)呈均質(zhì)半透明狀，如果出現(xiàn)白色混濁狀，一般出現(xiàn)在組織周圍或組織的底部，應(yīng)考慮這樣幾個(gè)方面的問題：a. 脫水不徹底。b.包埋蠟溫度低了，組織進(jìn)行包埋時(shí)，包埋框中的蠟已成凝結(jié)狀。c.組織內(nèi)還殘留有較多的透明劑，d.石蠟不純。 
④包埋箱中的溫度必須保持恒定。 
⑤如包埋得不好，可將蠟塊溶化，重新浸蠟和包埋。 
⑥較小的組織可在脫水透明時(shí)開始用伊紅染色

石蠟切片基本步驟之四 切片

六、石蠟切片制備
（一）石蠟切片前的準(zhǔn)備 
1．切片刀。傳統(tǒng)的切片刀在使用之前，一定要在顯微鏡下檢查刀口的損傷程度，然后進(jìn)行磨刀�，F(xiàn)在也可以使用一次性刀片，可省去磨刀。 
2．修整蠟塊：切去組織周圍過多的石蠟，一般情況下在組織周圍留有約1~2mm的石蠟邊，兩邊必須平行。 
3．蠟塊固定：修整好的蠟塊先固定在事先準(zhǔn)備好的小方木塊或者金屬塊上，固定方法是把蠟鏟先在酒精燈上加熱，再將蠟塊底部烙熔，迅速烙粘在小方木塊或金屬塊底座上。 
4．載玻片擦洗干凈后，在其表面涂上粘附劑（蛋白甘油、APES或多聚賴氨酸），根據(jù)染色方法選擇不同的粘附劑。 
5．準(zhǔn)備好毛筆、鑷子、染色架。 
6．調(diào)好展片器內(nèi)水的溫度（45℃），有時(shí)也可以加些酒精到水中。 
（二）石蠟切片 
1．將切片刀裝在刀片機(jī)的刀架上并固定緊，固定蠟塊底座或蠟塊，調(diào)整蠟塊與刀至合適位置，刀刃與蠟塊表面呈5度角。 
2．切片多使用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，切片時(shí)，左手執(zhí)毛筆，右手轉(zhuǎn)切片機(jī)轉(zhuǎn)輪，先修出組織塊。 
3．調(diào)整切片機(jī)上的切片厚度為4~7µm，然后切片。 
4．切片可以是單張，也可以是連續(xù)切片形成蠟帶 
5．展片和撈片： 
（1）直接展片法：在載玻片上滴加幾滴蒸餾水，然后把切片鋪在小滴上面，用酒精燈在載玻片下面加熱，待完全展平，傾斜載玻片，倒棄多余水分，同時(shí)擺正切片。 
（2）溫水漂浮法：此法用展片機(jī)或者用恒溫水浴箱，先使水溫保持在45~50℃，用左手拿毛筆輕輕托起切片，用右手用眼科鑷子夾起切片的一角，正面向上輕輕平鋪放置于展片器的水面上，動(dòng)作要輕快，切好的石蠟切片漂浮在溫水中受熱后及在表面張力的作用會(huì)自然平整地展開，必要時(shí)可用眼科鑷輕輕拔開，然后撈片，并及時(shí)編號(hào)。 
6．展好的切片在室溫下稍微干燥后，放在40℃恒溫烤箱中，小片組織30分鐘即可，大的需12~24小時(shí)，烤干備用。 
（三）注意事項(xiàng) 
1．切片刀刃傾斜過大或過小都不能正常進(jìn)行切片。 
2．修整蠟塊時(shí)要細(xì)心，看清楚組織在蠟塊中的位置，以免將需要的組織修掉。 
3．連續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī)的轉(zhuǎn)輪時(shí)，速度一定要均勻，不能時(shí)快時(shí)慢，以免切片厚薄不一。 
4．使用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片時(shí)，是由下向上切，為得到定然整的切片，防止組織出現(xiàn)刀紋裂縫，應(yīng)將組織硬、脆難切的部分放在上端，如皮膚應(yīng)將表皮部分向上，腸胃等組織應(yīng)將漿膜面面朝上。 
5．用展片器展片時(shí)，水溫應(yīng)根據(jù)使用的石蠟熔點(diǎn)進(jìn)行了調(diào)整，一般低于石蠟熔點(diǎn)10~15℃；撈片的時(shí)候動(dòng)作要輕、稍快。動(dòng)作太大容易出現(xiàn)氣泡。如果沒有展片器可以用溫水浴鍋來代替。 
6．單個(gè)切片要擺到載玻片的1/3與2/3交界處；連續(xù)切片的粘片順序一般是從左到右，組織切片較小是，可以并列粘貼2~3條蠟帶。 
7．烤片的溫度不宜過高；烤片的時(shí)間要合適。腦組織要待稍微晾干一些后，才能烤片，否則容易產(chǎn)生氣泡影響染色和觀察。 
七、H-E染色
（一）步驟 
1．脫蠟 
二甲苯I 10分鐘 
二甲苯II 5分鐘 
2．水化 
100%酒精I(xiàn) 5分鐘 
100%酒精I(xiàn)I 5分鐘 
95%酒精I(xiàn) 5分鐘 
95%酒精I(xiàn)I 5分鐘 
85%酒精 3分鐘 
75%酒精 2分鐘 
蒸餾水沖洗 1分鐘 
3．染色 
蘇木精染色 5分鐘 
自來水洗 
鹽酸酒精分化 15秒 
自來水洗（鏡檢） 
自來水洗 15分鐘 
0.5%伊紅染色 1分鐘 
蒸餾水洗 2分鐘 
75%酒精 2分鐘 
85%酒精 2分鐘 
95%酒精I(xiàn) 5分鐘 
95%酒精I(xiàn)I 5分鐘 
100%酒精I(xiàn) 5分鐘 
100%酒精I(xiàn)I 5分鐘 
二甲苯I 5分鐘 
二甲苯II 5分鐘 
4．封片 
中性樹膠封片 
上述處理好的玻片，取中性樹膠滴入載玻片的組織上，取蓋玻片從一端逐步蓋下去，避免發(fā)生氣泡 
（二）注意事項(xiàng) 
1．染色之前一定要了解清楚所用的染色液的配制方法，不同的染色液染色后的處理是不一樣的。 
2．染色過程中所用的時(shí)間要根據(jù)染色時(shí)的室內(nèi)溫度、染液的新鮮程度及實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況等靈活掌握。在室溫高、切片、染色液又是新配制的，染色時(shí)間就要短，反之時(shí)間就長(zhǎng)。 
3．伊紅有水溶的和醇溶的，如果用的是水溶的，應(yīng)該在脫水前進(jìn)行染色，如果是醇溶的，應(yīng)使用與溶解伊紅等濃度的酒精開始脫水。 
4．在二甲苯脫蠟之前可以先在60℃烤箱內(nèi)0.5~1小時(shí)，這樣可以使切片粘附更牢固不易脫片，也有利于脫蠟。 
5．二甲苯在HE染色中有脫蠟、透明的作用。二甲苯脫蠟的好壞主要取決于切片在二甲苯內(nèi)放置的時(shí)間和脫蠟時(shí)的溫度以及二甲苯的使用次數(shù)。染好的切片必須經(jīng)過透明，有利于顯微鏡觀察，同時(shí)并為封片起到了橋梁作用。 
6．用梯度酒精脫水時(shí)，在低濃度酒精中時(shí)間不宜過長(zhǎng)，到高濃度時(shí)逐步延長(zhǎng)脫水時(shí)間。以免脫水不徹底，影響二甲苯透明的效果。 
7．在酸性分化液內(nèi)停留的時(shí)間不要過長(zhǎng)，分化不可過度，避免使細(xì)胞核內(nèi)該染上色的結(jié)構(gòu)脫色。不需分化處理的蘇木精染色時(shí)要注意掌握染色時(shí)間，以防止組織切片染色背景過深或細(xì)胞核、胞質(zhì)染色不足。

光學(xué)顯微標(biāo)本的制作技術(shù)
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?br /> 了解光學(xué)顯微鏡切片制作技術(shù)的基本方法步驟。
【實(shí)驗(yàn)原理】
采用光學(xué)顯微鏡研究一般生物體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，在自然狀態(tài)下是無法觀察清楚的，多數(shù)動(dòng)、植物材料都必須經(jīng)過某種處理，將組織分離成單個(gè)細(xì)胞或薄片，光線才能通過細(xì)胞。為了適應(yīng)這個(gè)需要，就產(chǎn)生了光學(xué)顯微鏡制片技術(shù)。
光學(xué)顯微鏡的制片技術(shù)方法可分為兩大類：一類是非切片法，另一類是切片法。
非切片法，是用物理或化學(xué)的方法，使細(xì)胞彼此分離，如有分離法、涂布法、壓碎法等。非切片法的操作比較簡(jiǎn)單，能保侍細(xì)胞的完整，但是細(xì)胞之間的正常位置往往被更動(dòng)，無法反映細(xì)胞之間的正常聯(lián)系。它可以與切片法配合使用，各取其長(zhǎng)處。
切片法，是利用銳利的刃具將組織切成極薄的片層，材料須經(jīng)過一系列特殊的處理，如固定、脫水、包埋、切片、染色等，過程十分繁復(fù)。在制作過程中，還要經(jīng)過一系列的物理和化學(xué)的處理，這些處理方法可根據(jù)各種不同材料的性質(zhì)要求進(jìn)行合理選擇。切片法雖然工序繁瑣，技術(shù)復(fù)雜，但是，它最能保持細(xì)胞間的正常的相互關(guān)系，能較好和較長(zhǎng)時(shí)間地保留細(xì)胞的原貌，所以仍然是光學(xué)顯微鏡的主要制片方法。
【實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑】
（一）儀器：石蠟切片機(jī)、恒溫蠟箱、載玻片、蓋玻片
（二）材料：洋蔥根或小鼠肝
（三）試劑：乙醚、無水乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、重鉻酸鉀、鋨酸、正丁醇、二甲苯、石蠟、甘油、雞蛋、紗布、加拿大樹膠、麝香草酚
【方法與步驟】
光學(xué)顯微鏡切片制作技術(shù)最簡(jiǎn)單的切片法是徒手切片，但是由于組織塊往往十分柔軟，
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切削很困難，而且無法得到十分菲薄的切片，因此必須先用某些特殊物質(zhì)滲入組織塊的內(nèi)部起支持作用，并將整個(gè)組織塊包住，然后再用精密的切片機(jī)制作切片，才能獲得良好的效果。這種方法稱為包埋法，包埋的物質(zhì)稱為包埋劑。常用的包埋劑有石蠟、火棉膠、炭蠟、明膠等，水和塑料也可作為包埋劑。根據(jù)包埋劑的不同，分別有石蠟切片、火棉膠切片、冰凍切片等，它們各有長(zhǎng)處，可以根據(jù)需要選用，但是使用得最多的還是石蠟切片技術(shù)。
石蠟作為包埋劑，有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，例如：石蠟?zāi)芮谐鰳O薄的蠟片（2～10μm）；切片時(shí)能連成蠟帶，便于制作連續(xù)切片；操作較容易，組織塊可以包埋在石蠟中長(zhǎng)期保存。然而石蠟切片的制作過程較長(zhǎng)，步驟很多，一步不慎往往導(dǎo)致前功盡棄，而且這些處理引起組織塊或多或少地收縮，切片時(shí)受濕度影響比較大，這些不足之處必須在制片過程中認(rèn)真對(duì)待，盡量減小它的不良影響。
石蠟切片的制作過程主要包括：取材，固定，脫水，透明，透蠟，包埋，切片，貼片，染色，透明，封藏等步驟。
1．取材
材料的好壞直接影響到切片的質(zhì)量，無論取哪一種動(dòng)植物材料，以下幾點(diǎn)是必須注意的。
（1）植物材料選擇時(shí)須盡可能不損傷植物體或所需要的部分；動(dòng)物材料取用時(shí)常對(duì)動(dòng)物施以麻醉，常用的麻醉劑有氯仿和乙醚，或?qū)��?dòng)物殺死后迅速取出所需要的組織。
（2）取材必須新鮮，這一點(diǎn)對(duì)于從事細(xì)胞生物學(xué)研究尤為重要，應(yīng)該盡可能割取生活著的組織塊，并隨即投入固定液。
（3）切取材料時(shí)刀要銳利，避免因擠壓細(xì)胞使其受到損傷。
（4）切取的材料應(yīng)該小而薄，便于固定劑迅速滲入內(nèi)部。一般厚度不超過2mm，大小不超過5×5mm2。
2．固定
組織和細(xì)胞離開機(jī)體后，在一定時(shí)間內(nèi)仍然延續(xù)著生命活動(dòng)，會(huì)引起病理變化直至歸于死亡。為了使標(biāo)本能反映它生前的正常狀態(tài)，必須盡早地用某些化學(xué)藥品迅速地殺死組織和細(xì)胞，阻抑上述變化，并將結(jié)構(gòu)成分轉(zhuǎn)化為不溶性物質(zhì)，防止某些結(jié)構(gòu)的溶化和消失。這種處理就是固定。除了上述作用外，固定劑會(huì)使組織適當(dāng)硬化以便于隨后的處理，還會(huì)改變細(xì)胞內(nèi)部的折射系數(shù)并使某些部分易于染色。
固定劑的作用對(duì)象主要是蛋白質(zhì)，至于其他成分如脂肪和糖，在一般制作時(shí)不加考慮，如要觀察這些物質(zhì)，可用特殊的方法將其固定下來。
固定劑的作用表現(xiàn)在對(duì)材料體積的改變、硬化的程度、穿透的速度以及對(duì)染色的影響等方面。這些作用的好壞、大小，都依所固定的材料性質(zhì)而定，同樣一種固定液對(duì)某一材料來說是良好的，但對(duì)另外一些組織可能就不很適用。良好的固定劑必須具備的特征是：穿透組織的速度快。，能將細(xì)胞中的內(nèi)含物凝固成不溶解物質(zhì)，不使組織膨脹或收縮以保持原形，硬化組織的程度適中，增加細(xì)胞內(nèi)含物的折光度，增加媒染和染色能力，具有保存劑作用。 固定劑有簡(jiǎn)單固定劑和混合固定劑的劃分。
簡(jiǎn)單固定劑即單一的固定劑，常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀和鋨酸。其中，苦味酸、升汞、鉻酸既能凝固細(xì)胞清蛋白，又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白，而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、餓酸和重鉻酸鉀對(duì)這兩種蛋白質(zhì)都不凝固。
簡(jiǎn)單固定劑的局限性較大，如將其適當(dāng)混合，制成復(fù)合固定劑可以取得更好的效果。常用的混合固定劑有：
Bouin液（70份苦味酸飽和水溶液+25份4％甲醛+5份冰醋酸）、Zenker液（升汞5g＋重鉻酸鉀2.5g＋硫酸鈉1.0g＋5ml冰醋酸＋100ml蒸鎦水）、Carnoy改良液（3份無水乙醇+1份冰醋酸）等。固定劑的種類甚多，我們必須依據(jù)各種固定劑的性能及制片的不同要求來加以選擇。 19
固定時(shí)，須注意以下幾點(diǎn)：
（1）固定劑應(yīng)有足夠的量，一般為組織塊體積的10～15倍。
（2）如所固定的材料外表有不易穿透的物質(zhì)，可將材料先在含乙醇的溶液中固定幾分鐘，再移入水溶性的固定液。
（3）材料固定后如不立即下沉，可將其中氣泡抽出。
（4）固定時(shí)間依材料大小、固定劑種類而異，可從1小時(shí)到幾十小時(shí)，有時(shí)中間需要更新固定劑。某些固定劑對(duì)組織的硬化作用較強(qiáng)，作用時(shí)間應(yīng)嚴(yán)加控制，不能過長(zhǎng)。
（5）一般固定劑都以新配制的為好，用過的不能再用。有些混合固定劑由甲、乙兩液合并者，一定要在使用前才混合。
（6）固定完畢，根據(jù)所用固定劑的不同，用水或乙醇沖掉殘留的固定劑，以免固定劑形成沉淀，影響以后組織塊的染色。
3．脫水
生物組織中含有大量的水分，它和石蠟是不能相溶的，致使在包埋時(shí)石蠟無法滲入組織內(nèi)部，因此須使用脫水劑將水分除盡，這就是脫水的作用。
脫水劑必須能與水以任何比例相混合。脫水劑有兩類：一類是非石蠟溶劑，如乙醇、丙酮等，脫水后必須再經(jīng)過透明，才能透蠟包埋；另一類是兼石蠟溶劑，如正丁醇，脫水后即可直接透蠟。
常用的脫水劑是乙醇，因?yàn)樗鼉r(jià)格便宜，易于得到。為了避免劇烈的擴(kuò)散引起的組織的強(qiáng)烈收縮，脫水步驟應(yīng)從低到高以一定的濃度梯度來進(jìn)行，一般組織從30％乙醇開始，經(jīng)過50％、70％、80％、95％、100％至完全脫水；對(duì)于一些柔軟的組織應(yīng)從15％開始。脫水時(shí)間依據(jù)組織的類型和大小而定，一般各級(jí)乙醇中放置45min到1h，如果中間須停頓，應(yīng)使材料停留在70％乙醇中，因?yàn)榈蜐舛纫掖家资菇M織變軟、解體，高濃度乙醇有脆化組織作用，放置時(shí)間不能過長(zhǎng)，另外，脫水必須在有蓋瓶中進(jìn)行，以防止高濃度乙醇吸收空氣中水分導(dǎo)致濃度降低而使脫水不徹底。需要保存的材料可脫水至70%乙醇時(shí)停留其中，如需長(zhǎng)期保存，可加入等量的甘油。
丙酮也是很好的脫水劑，其作用和用法與乙醇相同，不過其脫水力和收縮力都比乙醇強(qiáng)。
甘油常用于藻類、菌類及柔弱材料的脫水。
二氧六環(huán)為無色的石蠟溶劑，對(duì)組織沒有收縮及硬化等不良后果，但其蒸氣有毒，使用時(shí)須小心。
正丁醇可與水及乙醇混合，亦為石蠟溶劑，其優(yōu)點(diǎn)是很少引起組織塊的收縮與變脆。
叔丁醇的性質(zhì)、作用和用法同于正丁醇，但因其價(jià)格昂貴而很少使用。
4．透明
組織塊用非石蠟溶劑脫水后必須經(jīng)過透明。透明劑能同時(shí)與脫水劑和石蠟混合，它取代了脫水劑后，石蠟便能順利地滲入組織。
透明劑的種類很多，較常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。
二甲苯作用較快，透明力強(qiáng)，但組織塊在其中停留過久，容易收縮變脆變硬，同時(shí)若脫水不凈，就會(huì)引起不良后果，在應(yīng)用時(shí)必須特別小心。通常將組織塊先經(jīng)純乙醇與二甲苯的等體積混合液，再進(jìn)入純二甲苯，這樣可減少上述的缺點(diǎn)。透明時(shí)間應(yīng)由組織大小而定，—般各級(jí)停留時(shí)間在30min至2h，在純二甲苯中應(yīng)更換2次，總時(shí)間則以不超過3h為宜。材料經(jīng)過透明，會(huì)顯示出前一步脫水的效果如何，若脫水徹底，組織則顯現(xiàn)透明狀態(tài)，如組織中有白色云霧狀，說明脫水不凈，須返工處理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明時(shí)，應(yīng)避免其揮發(fā)和吸收空氣中的水分，并保持其無水狀態(tài)。 20
甲苯的一般性質(zhì)與二甲苯相似。用法亦同，唯沸點(diǎn)較低，透明較慢，但不會(huì)使組織變脆。
苯的用法同于二甲苯，對(duì)組織的收縮作用小，但須警惕其爆炸和吸入而引起中毒。氯仿適于大塊組織的透明。
5．透蠟和包埋
包埋用的石蠟，熔點(diǎn)在50～60℃之間，應(yīng)根據(jù)材料本身的硬度、切片的厚薄和當(dāng)時(shí)的氣溫條件來選用。一般動(dòng)物材料最常用的石蠟熔點(diǎn)為52～56℃，植物材料的用54～58℃的；切片薄的用58～60℃的，切片厚的則用52～54℃的；室溫10～19℃時(shí)選用52～54℃的石蠟可順利切片，冬季可用熔點(diǎn)46～48℃的石蠟，夏季可選56～58℃的。
石蠟的優(yōu)劣與切片的成敗密切相關(guān)。鑒別石蠟質(zhì)量的方法是：將石蠟熔化后倒入紙盒使其凝結(jié)且無氣泡和裂痕，30～35℃放置24h且無氣泡和不透明的晶狀小點(diǎn)出現(xiàn)，蠟塊裂面不呈顆粒狀，切成薄片不碎成細(xì)粒。這種石蠟即為品質(zhì)優(yōu)良。含有雜質(zhì)的新蠟或用過的廢蠟可清潔后再用，方法是將石蠟放入鍋內(nèi)，加熱到開始冒白煙，然后用小火繼續(xù)加熱30min（注意別超過發(fā)火點(diǎn)），使其去除水分和揮發(fā)性雜質(zhì)，并在溫箱中過濾以去除灰塵等顆粒。
透蠟須在恒溫箱中進(jìn)行，恒溫箱的溫度調(diào)節(jié)至高于石蠟熔點(diǎn)3度，使經(jīng)過透明的組織塊依次用石蠟與二甲苯的等量混合液、純石蠟處理。純石蠟應(yīng)處理2～3次，透蠟的時(shí)間依材料性質(zhì)而定，一般每次需15～30min。
透明的關(guān)鍵是控制溫度的恒定，切忌忽高忽低，溫度過低石蠟?zāi)�固無法滲透，溫度過高使組織收縮發(fā)脆。
包埋是使浸透蠟的組織塊包裹在石蠟中。具體做法是；先準(zhǔn)備好紙盒（具體折法見圖1-3及說明），將熔蠟倒入盒內(nèi)，迅速用預(yù)溫的鑷子夾取組織塊平放在紙盒底部，切面朝下，再輕輕提起紙盒，平放在冷水中，待表面石蠟?zāi)�固后立即將紙盒按入水中，使其迅速冷卻凝固，30min后取出。
包埋用蠟的溫度應(yīng)略高于透蠟溫度，保證組織塊與周圍石蠟完全融為一體。石蠟的迅速冷卻也很重要，否則包埋塊中將會(huì)產(chǎn)生結(jié)晶。以后切片時(shí)引起碎裂。
6．切片
（1）石蠟塊的固著與整修
在包埋以后，就可進(jìn)行切片。包埋好的石蠟塊裝上切片機(jī)進(jìn)行切片前還須進(jìn)行固著和整修。
固著：一般旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)上都附有可固著石蠟塊的金屬小盤，這也可用同樣大小的臺(tái)木替代。用加熱的蠟鏟將包埋塊粘貼于固著物上，并使組織塊朝外，便于以后迅速切出所需的片子。
整修：用加熱的蠟鏟或刀片將固著的包埋塊四周修平，使上下兩面修成平行面，常保留組織周圍附著寬2～3mm的石蠟，而修好的蠟塊呈長(zhǎng)方形。還可削去一角以便于在蠟帶上識(shí)別切片。
（2）切片機(jī)和切片刀
切片機(jī)是用來作各種組織切片的一種專門設(shè)計(jì)的精密機(jī)械，常用的是旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)，它的夾物部分是上下移動(dòng)前后推進(jìn)的，而夾刀部分則固定不動(dòng)。主要部件是安裝切片刀的刀臺(tái)、安裝包埋塊的標(biāo)本臺(tái)和控制切片厚度的微動(dòng)裝置。切片時(shí)切片刀固定不動(dòng)，轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)輪，標(biāo)本臺(tái)上下運(yùn)動(dòng)并按調(diào)好的切片厚度向前推進(jìn)一定的距離，組織塊上下運(yùn)動(dòng)一次，便在刀片上得到一張合乎厚度要求的切片。
切片刀與切片的質(zhì)量直接相關(guān)。切片前必須磨刀，方法是：將切片刀裝上刀柄、刀背夾、滴少許石蠟油在平滑的磨刀石上，將刀貼著磨刀石以背向刀口方向磨，使用完畢后應(yīng)及時(shí)用二甲苯將石蠟油擦凈。
（3）切片方法
切片前，將刀口置放大鏡下觀察，選擇刀口平整無缺刻的部分來進(jìn)行切削。將所要切的包埋塊固定在標(biāo)本臺(tái)上，使包埋塊外切面與標(biāo)本夾截面平行，并讓包埋塊稍露出一截。將刀臺(tái)推至外緣后松開刀片夾的螺旋，上好刀片，使切片刀平面與組織切面間呈15°左右的夾角，包埋塊上下邊與刀口平行。在微動(dòng)裝置上調(diào)節(jié)切片要求的厚度，調(diào)節(jié)時(shí)應(yīng)注意指針不可在兩個(gè)刻度之間，否則容易損傷切片機(jī)，將刀臺(tái)移至近標(biāo)本臺(tái)處，讓刀口與組織切面稍稍接觸，這時(shí)就可以開始切片了。方法是：右手轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)輪，左手持毛筆在刀口稍下端接隹切好的片子，并托住切下的蠟帶，待蠟帶形成一定長(zhǎng)度后，右手停止轉(zhuǎn)動(dòng)，持另一枝毛筆輕輕將蠟帶挑起，平放于襯有黑紙的紙盒內(nèi)，注意切片速度不宜太快，搖動(dòng)轉(zhuǎn)輪用力應(yīng)均勻，防止切片機(jī)震動(dòng)厲害引起切片厚薄不均勻，還應(yīng)注意轉(zhuǎn)動(dòng)的方向，以防標(biāo)本臺(tái)后移而切不到片子。切片完畢，應(yīng)及時(shí)用氯仿將切片機(jī)的有關(guān)部分擦凈。
（4）切片中存在的問題及補(bǔ)救方法
石蠟切片是很不容易掌握的，有時(shí)很容易成功，有時(shí)則由于某種因素而造成切片的質(zhì)量低劣，甚至完全失敗。現(xiàn)將切片時(shí)經(jīng)常遇到的一些缺點(diǎn)、可能的原因以及補(bǔ)救辦法列于表1-3。

表1-3 石蠟切片可能產(chǎn)生的問題和解決方法

缺 點(diǎn)：石蠟帶彎曲不直
原 因：
1．石蠟塊上下兩邊不平行
2．石蠟塊的上下兩邊不和刀口平行
3．刀口鋒利不一，局部產(chǎn)生差異
4．蠟塊的一邊較另一邊為軟，或兩邊的硬度不一致
5．材料未居蠟塊正中央
6．材料大而形不正
補(bǔ) 救 辦 法 ：
1．取下臺(tái)木，將兩邊修干
2．調(diào)節(jié)標(biāo)本臺(tái)，使兩者平行
3．移動(dòng)刀片，改用新的刀口
4．待蠟塊冷卻后再切，或重新包埋
5．用刀片切去部分石蠟，使材料居中
6．在大的一邊切去少許石蠟

缺 點(diǎn)：切片分離、不能連成帶狀
原 因：
1．室溫過低
2．石蠟過硬
3．材料邊緣留蠟太少
4．刀的角度不適合
補(bǔ) 救 辦 法 ：
1．在切片機(jī)上方開一電燈或提高室溫
2．在蠟塊面加一層45℃的軟蠟或用手指蠟?zāi)Σ翂K面
3．重新包埋
4．矯正刀的角度

缺 點(diǎn)：切片卷起呈圓筒狀
原 因：
1．室溫過低
2．石蠟過硬
3．刀口太鈍
4．刀的傾角太大
補(bǔ) 救 辦 法 ：
1．提高室溫
2．加軟蠟
3用毛筆將蠟片攤開壓住，切2—3 片即成帶
4．減小傾角

缺 點(diǎn)：切片粘附于切片刀，皺摺在一起
原 因：
1．室溫過高
2．石蠟過軟
3．刀口上留有一層石蠟
4．刀口鈍
補(bǔ) 救 辦 法 ：
1．降低室溫
2．將蠟塊投入涼水中稍浸耒—增加
3．切片厚度，改用硬蠟包埋，用二甲苯拭去刀口的石蠟
4．磨刀或移動(dòng)刀口

缺 點(diǎn)：切片縱裂
原 因：
1．刀有缺口
2．石蠟塊中含有顆粒、雜質(zhì)
3．刀口留有碎屑或細(xì)絲
4．組織太硬
補(bǔ) 救 辦 法 ：
1．可移動(dòng)刀口
2．將顆粒拽去
3．清潔刀口
4．讓包埋塊在水中浸泡

缺 點(diǎn)：切片有橫紋
原 因：
1．刀和臺(tái)木的固定螺絲太松
2．刀口傾斜度太大
3．刀口有石蠟屑
補(bǔ) 救 辦 法 ：
1．旋緊螺旋
2．可放平1—2。后再切
3．用氯仿拭去

缺 點(diǎn)：切片厚薄不勻
原 因：
1．切片機(jī)有毛病
2．夾刀不當(dāng)
3，未旋緊標(biāo)本臺(tái)螺旋
4。石蠟塊過硬
補(bǔ) 救 辦 法 ：
1．矯正切片機(jī)裝置
2．對(duì)癥治療
3．旋緊螺旋
4．將石蠟塊在水中浸泡

缺 點(diǎn)：每張切片厚薄不勻
原 因：
1．刀口震動(dòng)，是由于材料過硬
2．刀的傾角太大
補(bǔ) 救 辦 法 ：
1。在蠟塊表面涂一層火棉膠
2．減小傾角

缺 點(diǎn)：材料發(fā)生裂隙破碎或脫落
原 因：
1．脫水不干凈
2．有透明劑殘留
3．石蠟透入時(shí)，溫度過高或時(shí)間過長(zhǎng)
4．由于脫水劑和透明劑的影響，使組織變硬發(fā)脆
5．材料太硬或太粗
補(bǔ) 救 辦 法 ：
1．無法彌補(bǔ)
2．增加浸蠟時(shí)間，重新包埋
3．無法補(bǔ)救
4．用正丁醇、叔丁醇和二氧六環(huán)等進(jìn)行脫水和透明
5．在蠟塊表面涂一薄層火棉膠溶液 

缺 點(diǎn)：切片時(shí)發(fā)生沙沙聲
原 因：
1．組織塊過硬
2．包埋溫度過高
3，材料內(nèi)留有結(jié)晶體
補(bǔ) 救 辦 法 ：
1．浸泡水中軟化
2．無法補(bǔ)救
3．無法補(bǔ)救

缺 點(diǎn)：石蠟塊將蠟帶抬起
原 因：
1．由于摩擦而產(chǎn)生靜電荷所致
2．石蠟塊上面附有石蠟碎屑
3．刀口上附有石蠟碎屑
補(bǔ) 救 辦 法 ：
1．提高室溫
2．用刀片將碎屑清除
3．用二甲苯或氧仿清除

7．貼片
切好的切片必須貼附于載玻片上才能作進(jìn)一步處理，但是切片常有細(xì)小的橫紋，必須經(jīng)展平后才能貼附，否則影響染色和觀察。
貼片一般有撈片法和燙板法。
撈片法比較簡(jiǎn)單，首先將切片分割開，投入到48℃的溫水浴中，這時(shí)切片都浮在水面上，由于表面張力的作用使切片自然展平，然后用涂有甘油蛋白溶液（將雞蛋一個(gè)打破入杯中，去除蛋黃留下蛋白，用筷子充分調(diào)打成雪花狀泡沫，然后用雙層紗布過濾至容器中，加入等量的甘油，混合，最后加入百分之一體積的麝香草酚（thymol）作防腐用，可保存幾個(gè)月到一年。）或5％明膠水溶液的載玻片傾斜著插入水面去撈取切片，使切片貼附在載玻片的合適位置，于室溫下放置一晝夜后使其徹底干燥。
燙板法，是將涂有粘片劑的載玻片上涂上水，把已分割好的切片貼上去，再置載玻片于35℃恒定的燙板上讓切片攤干，并傾斜或用吸水紙吸去水分，最后將載玻片再度放燙板上晾干。
要注意，不管是使用撈片法還是燙板法，所用的載玻片必須潔凈，不能有油污（檢驗(yàn)法：已涂有粘片劑的載玻片上滴加數(shù)滴蒸餾水，若發(fā)現(xiàn)水不均勻分散而聚成滴狀，即表示載玻片不清潔，有殘留油脂等物在上面）；切片的光面應(yīng)朝下，否則染色過程中切片容易脫落。
8．染色
組織切片是無色透明的，必須進(jìn)行染色后才能觀察到各種微細(xì)結(jié)構(gòu)。染色方法很多，但是染色劑往往是水溶液，因此切片必須經(jīng)過脫蠟而再度復(fù)水。這方法即為脫水、透明的逆過程。由于切片十分菲薄，處理的時(shí)間大大減少，一般每級(jí)停留約2～5min。
染色是一個(gè)復(fù)雜的過程，兼有物理和化學(xué)作用，對(duì)其中的機(jī)制目前了解得不很清楚。研究細(xì)胞器和細(xì)胞內(nèi)的重要組分都有很多現(xiàn)成的方法，例如顯示DNA的Feulgen反應(yīng)，顯示RNA的Brachet反應(yīng)，顯示多糖的PAS反應(yīng)，顯示蛋白質(zhì)的Millon反應(yīng)和顯示某些酶的鈣—鈷法等，可以根據(jù)不同的要求來選用。
9．透明
染色后的切片須再次經(jīng)過脫水、透明。標(biāo)本經(jīng)二甲苯透明后，折射率改變，透明度提高，使得染上色的部位更清晰地顯示出來。
10．封藏
封藏的目的是使制成的切片能夠永久保存，封藏劑必須能與透明劑互溶，對(duì)染色無影響，折射率近似玻璃和具有粘性的物質(zhì)，常用的封藏劑有加拿大樹膠和中性樹膠。
封片的方法是：將載玻片從二甲苯中吸出后，吸去多余的二甲苯，在標(biāo)本上的二甲苯尚未干透之前加一滴樹膠，仔細(xì)覆蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡，也不得拖動(dòng)蓋玻片，以免將標(biāo)本破壞。樹膠量視蓋玻片大小而定，勿使過多過少。
貼上標(biāo)簽，注明材料、染色法，待封藏劑凝固后便成為一張成功的石蠟切片。