mRNA脂質納米顆粒生物分布與基因表達之間的關系
基于信使RNA（mRNA）的治療，簡單來講就是化學修飾后的的mRNA進入細胞后利用細胞內的資源翻譯出機體所需的蛋白質。然而，在mRNA進入機體那一刻到進入靶細胞的過程中，面臨著穩(wěn)定性、免疫原性、跨越多種生物屏障等的挑戰(zhàn)。為此，研究人員陸續(xù)開發(fā)出多種mRNA遞送系統，其中一種主流的遞送方式就是用于制備新冠疫苗的脂質納米顆粒（LNP）技術。目前，除了熟知的疫苗外，通過蛋白替換、基因編輯等手段，LNP已在代謝疾病、癌癥等治療中展示出巨大的潛力。
在mRNA LNP開發(fā)過程中，明確其藥物代謝動力學（PK）-藥物效應動力學（PD）關系至關重要。雖然LNP的體內暴露是遞送、表達mRNA的前提條件，但暴露量與表達效果之間并不存在必然的聯系。局部注射的mRNA LNP可能會從注射部位遷移、積聚到機體的其它組織，高效轉染親和力較高的細胞，將mRNA攜帶的指令兌換成所需蛋白。例如，普遍認為肌內注射的mRNA LNP主要靶向肌細胞，但事實上，在肝臟也能看到相當的蛋白表達。
為了探討mRNA LNP體內分布狀況與PK之間的關系，來自上海交通大學的徐宇虹團隊構建了攜帶螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase）mRNA的LNP并利用DiR或氘代膽固醇進行標記，通過生物發(fā)光成像以及熒光素酶活性測定來研究mRNA LNP的體內表達情況、DiR熒光成像以及氘代膽固醇含量分析來追蹤mRNA LNP的體內分布情況。結果發(fā)現，雖然經肌肉注射進體內的Fluc-mRNA LNP在注射部位的含量最高，該部位的轉染效果不如肝臟、脾臟和淋巴結，驗證了mRNA LNP生物分布與基因表達之間的非線性關系。
此外，這些LNP的生物分布、基因表達受給藥方式、顆粒大小等因素的影響。該研究結果發(fā)表在國際期刊《Pharmaceutical Research》上，題目為Biodistribution and Non-linear Gene Expression of mRNA LNPs Affected by Delivery Route and Particle Size。
肌肉注射后，mRNA LNP的體內分布狀況
首先，作者將可電離脂質H3、HSPC、膽固醇以及DMG-PEG 2000溶解到乙醇中，再把這些脂質混合物快速注射到含EZ Cap™ firefly luciferase mRNA的水溶液中，得到Fluc-mRNA LNP。在制備上述脂質混合物時，作者還會加入熒光染料DiR或氘代膽固醇進行標記，以便追蹤mRNA LNP的體內分布情況。
肌肉組織的熒光信號隨時間增加，在第48小時最強，而肝臟信號在第7小時達到峰值后逐漸減弱。
總體而言，mRNA LNP在體內主要分布于肌肉組織，此次是肝臟。同樣地，通過LC/MS定量分析體內不同部位的氘代膽固醇含量，并將每個部位的LNP%計算出來，有60~80% LNP都在肌肉組織，10~20%在肝臟，僅有1~2%在脾臟。
肌肉注射后，mRNA LNP的體內轉染效果
為了研究上述LNP運載的mRNA在聚集部位的釋放情況，作者將編碼卵清蛋白的OVAL-mRNA替代Fluc-mRNA，LNP肌肉注射2小時后收集肌肉組織，肝臟，引流淋巴結并使用Cy5標記的寡核苷酸探針進行原位雜交。
結果顯示，在注射部位的肌細胞內僅檢測出微弱的mRNA信號，而肝細胞和淋巴細胞內的信號尤為清晰。
此外，以同樣的給藥方式將載有Fluc-mRNA的LNP注射到小鼠體內后，研究人員不僅在注射部位，在肝臟也檢測到熒光素酶。熒光素酶活性測定數據（以組織的總重量對數據進行標準化處理）表明，Fluc-mRNA LNP在肝臟、脾臟和淋巴結的表達水平均高于肌肉組織。
不同給藥方式下，Fluc-mRNA LNP的體內分布、表達狀況
接下來，作者將DiR標記的Fluc-mRNA LNP以3種不同的給藥方式注射到小鼠體內，并比較了各組小鼠體內Fluc-mRNA LNP的分布、表達狀況。其中，經靜脈注射的mRNA LNP主要在肝臟積聚、表達，生物發(fā)光強度在第4小時達到峰值并在注射后48小時內迅速減弱至背景水平。
相比之下，經肌肉注射的mRNA LNP雖然有大部分停留在注射部位，但在注射部位和肝臟均能觀察到明顯的生物發(fā)光，而且，生物發(fā)光的時間、強度較前者慢、弱。至于皮下注射的mRNA LNP，主要在注射部位積聚、表達，生物發(fā)光強度最弱。
大小各異的Fluc-mRNA LNP的體內分布、表達狀況
除給藥方式外，作者最后還探討了顆粒大小這個因素對Fluc-mRNA LNP體內分布、表達的影響。在維持脂質組成、mRNA/脂質比率不變的前提下，制備了小、中、大3種尺寸的Fluc-mRNA LNP。
肌肉注射后，小的顆粒更容易遷移到肝臟，而大的顆粒會積聚于注射部位的肌肉組織。有趣的是，盡管小LNP在肝臟的濃度最高，但其轉染效果不如中LNP，大LNP效果最差。
總之，該研究揭示了mRNA LNP體內分布與基因表達之間的非線性關系并明確了與之相關的影響因素。這些結果拓展了我們對mRNA LNP體內狀況的認識，有望為高靶向性、高轉染效率mRNA LNP的開發(fā)提供新思路。
在mRNA LNP開發(fā)過程中，明確其藥物代謝動力學（PK）-藥物效應動力學（PD）關系至關重要。雖然LNP的體內暴露是遞送、表達mRNA的前提條件，但暴露量與表達效果之間并不存在必然的聯系。局部注射的mRNA LNP可能會從注射部位遷移、積聚到機體的其它組織，高效轉染親和力較高的細胞，將mRNA攜帶的指令兌換成所需蛋白。例如，普遍認為肌內注射的mRNA LNP主要靶向肌細胞，但事實上，在肝臟也能看到相當的蛋白表達。
為了探討mRNA LNP體內分布狀況與PK之間的關系，來自上海交通大學的徐宇虹團隊構建了攜帶螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase）mRNA的LNP并利用DiR或氘代膽固醇進行標記，通過生物發(fā)光成像以及熒光素酶活性測定來研究mRNA LNP的體內表達情況、DiR熒光成像以及氘代膽固醇含量分析來追蹤mRNA LNP的體內分布情況。結果發(fā)現，雖然經肌肉注射進體內的Fluc-mRNA LNP在注射部位的含量最高，該部位的轉染效果不如肝臟、脾臟和淋巴結，驗證了mRNA LNP生物分布與基因表達之間的非線性關系。此外，這些LNP的生物分布、基因表達受給藥方式、顆粒大小等因素的影響。該研究結果發(fā)表在國際期刊《Pharmaceutical Research》上，題目為Biodistribution and Non-linear Gene Expression of mRNA LNPs Affected by Delivery Route and Particle Size。
肌肉注射后，mRNA LNP的體內分布狀況
首先，作者將可電離脂質H3、HSPC、膽固醇以及DMG-PEG 2000溶解到乙醇中，再把這些脂質混合物快速注射到含EZ Cap™ firefly luciferase mRNA的水溶液中，得到Fluc-mRNA LNP。在制備上述脂質混合物時，作者還會加入熒光染料DiR或氘代膽固醇進行標記，以便追蹤mRNA LNP的體內分布情況。
肌肉組織的熒光信號隨時間增加，在第48小時最強，而肝臟信號在第7小時達到峰值后逐漸減弱。
總體而言，mRNA LNP在體內主要分布于肌肉組織，此次是肝臟。同樣地，通過LC/MS定量分析體內不同部位的氘代膽固醇含量，并將每個部位的LNP%計算出來，有60~80% LNP都在肌肉組織，10~20%在肝臟，僅有1~2%在脾臟。
肌肉注射后，mRNA LNP的體內轉染效果
為了研究上述LNP運載的mRNA在聚集部位的釋放情況，作者將編碼卵清蛋白的OVAL-mRNA替代Fluc-mRNA，LNP肌肉注射2小時后收集肌肉組織，肝臟，引流淋巴結并使用Cy5標記的寡核苷酸探針進行原位雜交。
結果顯示，在注射部位的肌細胞內僅檢測出微弱的mRNA信號，而肝細胞和淋巴細胞內的信號尤為清晰。
此外，以同樣的給藥方式將載有Fluc-mRNA的LNP注射到小鼠體內后，研究人員不僅在注射部位，在肝臟也檢測到熒光素酶。熒光素酶活性測定數據（以組織的總重量對數據進行標準化處理）表明，Fluc-mRNA LNP在肝臟、脾臟和淋巴結的表達水平均高于肌肉組織。
不同給藥方式下，Fluc-mRNA LNP的體內分布、表達狀況
接下來，作者將DiR標記的Fluc-mRNA LNP以3種不同的給藥方式注射到小鼠體內，并比較了各組小鼠體內Fluc-mRNA LNP的分布、表達狀況。其中，經靜脈注射的mRNA LNP主要在肝臟積聚、表達，生物發(fā)光強度在第4小時達到峰值并在注射后48小時內迅速減弱至背景水平。
相比之下，經肌肉注射的mRNA LNP雖然有大部分停留在注射部位，但在注射部位和肝臟均能觀察到明顯的生物發(fā)光，而且，生物發(fā)光的時間、強度較前者慢、弱。至于皮下注射的mRNA LNP，主要在注射部位積聚、表達，生物發(fā)光強度最弱。
大小各異的Fluc-mRNA LNP的體內分布、表達狀況
除給藥方式外，作者最后還探討了顆粒大小這個因素對Fluc-mRNA LNP體內分布、表達的影響。在維持脂質組成、mRNA/脂質比率不變的前提下，制備了小、中、大3種尺寸的Fluc-mRNA LNP。
肌肉注射后，小的顆粒更容易遷移到肝臟，而大的顆粒會積聚于注射部位的肌肉組織。有趣的是，盡管小LNP在肝臟的濃度最高，但其轉染效果不如中LNP，大LNP效果最差。總之，該研究揭示了mRNA LNP體內分布與基因表達之間的非線性關系并明確了與之相關的影響因素。這些結果拓展了我們對mRNA LNP體內狀況的認識，有望為高靶向性、高轉染效率mRNA LNP的開發(fā)提供新思路。
