1.什么是納米抗體
納米抗體是由比利時(shí)科學(xué)家于1993年在自然雜志中首次報(bào)道。傳統(tǒng)抗體分子(IgG)是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈組成的結(jié)構(gòu)比較保守的抗體分子?贵w分子的輕鏈包含1個(gè)VL區(qū)和1個(gè)CL區(qū),而重鏈則擁有1個(gè)VH區(qū)和3個(gè)CH區(qū)(CH1、CH2和CH3)。
羊駝只有重鏈抗體缺少輕鏈,由4個(gè)HC和2個(gè)VH組成,其中VHH區(qū)域又被稱(chēng)為納米抗體或單域抗體(single domain antibody,sdAb),納米抗體(Nanobody, Nb)晶體為2.5nm,長(zhǎng)4nm,分子量只有15KDa。納米抗體主要用于生物醫(yī)藥研發(fā)(基因工程藥物研發(fā)、ADC藥物研發(fā));用于臨床體外診斷(膠體金法、酶聯(lián)免疫吸附法、電化學(xué)發(fā)光法);用于腫瘤研究、免疫學(xué)等基礎(chǔ)研究領(lǐng)域,目前CAR-T治療型抗體開(kāi)發(fā)受到越來(lái)越多科研工作者的關(guān)注。
2.納米抗體的優(yōu)缺點(diǎn)
2.1 納米抗體的優(yōu)點(diǎn)
(1)在高溫和pH下的穩(wěn)定性;
(2)VHH可以識(shí)別通常不被常規(guī)抗體識(shí)別的抗原位點(diǎn);
(3)它們的小分子片段有助于快速組織滲透和標(biāo)記應(yīng)用,包括跨越血腦屏障;
(4)用于大規(guī)模生產(chǎn)節(jié)約成本的替代品。
2.2納米抗體的缺點(diǎn)
納米抗體(VHH抗體)由于分子量較小,約為15kDa,相當(dāng)于傳統(tǒng)IgG抗體重鏈或輕鏈的可變區(qū),因此針對(duì)VHH抗體的二抗不具有普遍適用性,需要將VHH融合Fc片段進(jìn)行共表達(dá)進(jìn)行解決二抗識(shí)別問(wèn)題(卡梅德生物提供多種抗羊駝二抗,可用于免疫血清效價(jià)檢測(cè),Cat.#:SPAB01,SPAB03)
3.納米抗體(VHH抗體)主要應(yīng)用方向
基于納米抗體優(yōu)良的性能,目前被廣泛應(yīng)用于CAR-T治療型抗體開(kāi)發(fā)。
CAR-T療法是嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法,這是一種治療腫瘤的新型精準(zhǔn)靶向療法。通過(guò)基因工程技術(shù),將T細(xì)胞激活,并裝上定位導(dǎo)航裝置CAR(腫瘤嵌合抗原受體),將T細(xì)胞這個(gè)普通“戰(zhàn)士”改造成“超級(jí)戰(zhàn)士”,即CAR-T細(xì)胞,他利用其“定位導(dǎo)航裝置”CAR,專(zhuān)門(mén)識(shí)別并消滅體內(nèi)腫瘤細(xì)胞,從而達(dá)到腫瘤治療的目的。
4.卡梅德生物能夠?yàn)榭蛻?hù)提供高質(zhì)量的駝源納米抗體開(kāi)發(fā)服務(wù)
卡梅德生物可以提供多種駝源納米抗體開(kāi)發(fā)服務(wù),包括羊駝、大羊駝、駱駝、美洲駝等,基于噬菌體展示技術(shù)平臺(tái),卡梅德生物可以提供包括抗原設(shè)計(jì)、羊駝免疫、文庫(kù)構(gòu)建與篩選、活性功能驗(yàn)證等主要實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié),并為全球的科學(xué)家提供高特異性和高親和力的羊駝VHH抗體。
5.卡梅德生物為客戶(hù)提供駝源抗體開(kāi)發(fā)的全流程介紹
主要包括以下步驟:羊駝免疫,噬菌體文庫(kù)構(gòu)建,抗體庫(kù)篩選,抗體表達(dá)與功能驗(yàn)證。詳細(xì)流程如下:
5.1羊駝免疫
卡梅德生物提供健康的成年羊駝(28-36月大)進(jìn)行免疫,約16-20周即可獲得高質(zhì)量的文庫(kù)和單抗細(xì)胞株,交付完整的實(shí)驗(yàn)過(guò)程記錄和免疫動(dòng)態(tài)視頻。卡梅德生物根據(jù)客戶(hù)的抗原類(lèi)型,會(huì)制定特定的免疫抗原制備方案以及免疫方案。
5.1.1抗原準(zhǔn)備:客戶(hù)提供抗原,弗氏佐劑的使用量是1ml,將抗原和佐劑以1:1混合進(jìn)行免疫。
5.1.2羊駝免疫:免疫5次,每次間隔20天,在羊駝?lì)i部進(jìn)行注射,免疫后1小時(shí)觀察羊駝是否有不適癥狀。
5.1.3采血:免疫前進(jìn)行采血,留作陰性對(duì)照,在第三、第四次免疫后間隔一星期進(jìn)行采血5ml效價(jià)測(cè)定,ELISA檢測(cè)血清效價(jià),效價(jià)滿(mǎn)足要求>10
5?返律餅榭蛻(hù)提供清晰的免疫時(shí)間節(jié)點(diǎn)信息表,如表1所示:
表1:卡梅德生物納米抗體制備免疫時(shí)間進(jìn)程舉例
次數(shù) |
免疫日期 |
第一次 |
2020年11月25日 |
第二次 |
2020年12月16日 |
第三次 |
2021年1月6日 |
第四次 |
2021年1月27日 |
第五次 |
2021年2月18日 |
5.1.4PBMC細(xì)胞分離:取外周血100-120mL,PBMC細(xì)胞總數(shù)為4*10
7-10
8個(gè),全部郵寄給客戶(hù)。
5.2噬菌體文庫(kù)構(gòu)建
卡梅德生物使用M13噬菌體的pIII蛋白進(jìn)行VHH抗體(納米抗體)表面展示,制備TG1電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,構(gòu)建噬菌體載體,并進(jìn)行噬菌體庫(kù)容測(cè)定。
5.2.1RNA提取:按照商業(yè)化試劑盒操作進(jìn)行RNA提取。

5.2.2CDNA反轉(zhuǎn)錄合成:按照商業(yè)化試劑盒操作進(jìn)行cDNA制備。
5.2.3PCR擴(kuò)增:以cDNA為模板,PCR擴(kuò)增重鏈抗體基因可變區(qū),擴(kuò)增2輪。
5.2.4連接載體并電轉(zhuǎn)化:酶切、連接噬菌粒載體,電擊轉(zhuǎn)化TG1宿主菌,構(gòu)建抗體庫(kù)。
5.2.5細(xì)菌文庫(kù)/噬菌體文庫(kù)建立:計(jì)算庫(kù)容量,庫(kù)容量交付標(biāo)準(zhǔn)10
8~10
9。
5.3抗體庫(kù)篩選
常規(guī)使用的篩選方法是固相篩選,磁珠和細(xì)胞篩選(常用于GPCR,離子通道受體的抗體篩選)。
卡梅德生物為客戶(hù)提供定制化的篩選體系,根據(jù)客戶(hù)的需求不同,我們提供固相篩選,固相/液相篩選以及細(xì)胞篩選的方法。前兩者適用于蛋白,多肽一類(lèi)靶抗原的篩選;第三種適用于GPCR,離子通道受體的抗體篩選。通過(guò)不同的篩選方法,可以為客戶(hù)高效的篩選出不同類(lèi)型的阻斷型抗體
5.4抗體表達(dá)與功能驗(yàn)證
5.4.1表達(dá):構(gòu)建哺乳表達(dá)體系進(jìn)行抗體表達(dá),卡梅德建立了完善的哺乳表達(dá)體系,包括但不限于FreeStyle 293-F cell line和Expi CHO-S等細(xì)胞系,配合卡梅德設(shè)計(jì)的高表達(dá)載體(含有全長(zhǎng)的CMV啟動(dòng)子以及優(yōu)化后的分泌信號(hào)肽序列)進(jìn)行重組抗體表達(dá)與制備。

5.4.2純化:納米抗體過(guò)鎳柱純化。
5.4.3親和力測(cè)定:將純化好的納米抗體進(jìn)行Biacore親和力檢測(cè)。
卡梅德生物科技(天津)有限公司于2014年成立于中國(guó)天津,在西北地區(qū)擁有大型的羊駝養(yǎng)殖基地,公司每年為科研用戶(hù)提供200+羊駝納米抗體制備服務(wù),制備周期短,約16-20周即可獲得高質(zhì)量的文庫(kù)和單抗細(xì)胞株,可交付VHH抗體文庫(kù)2ml,庫(kù)容量高達(dá)10
8-10
9,歡迎廣大科研用戶(hù)朋友來(lái)咨詢(xún)。