CRISPR/Cas9敲除細胞系構建方案

1.什么是CRISPR/Cas9敲除細胞系
CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是新出現(xiàn)的一種由sgRNA指導Cas核酸內(nèi)切酶對靶向基因進行特定DNA修飾的技術。CRISPR/Cas9系統(tǒng)廣泛存在于原核生物基因中，是細菌和古細菌為應對病毒和質(zhì)粒不斷攻擊而演化來的一種適應性免疫防御機制。
 
2.CRISPR/Cas9敲除細胞系的原理
CRISPR/Cas系統(tǒng)分為兩大類，最典型和應用最廣泛的 CRISPR 系統(tǒng)是 II 型 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)。在II型CRISPR系統(tǒng)中，CRISPR RNA（crRNA）通過堿基配對與轉(zhuǎn)錄激活crRNA（Trans-activating crRNA，tracrRNA）退火形成能夠特異識別基因組序列的復
合體，然后通過PAM（5’-NGG-3’）序列結合并侵入DNA，引導Cas9核酸內(nèi)切酶在目的片段切割使DNA雙鏈斷裂（double-strand breaks，DSBs）。 
   
 
3.CRISPR/Cas9敲除細胞系的服務優(yōu)勢
（1）具有編輯效率高、構建簡單、操作方便等優(yōu)點
（3）能夠成本低廉地實現(xiàn)有效靈活的基因敲除
（4）具有廣譜性，無基因、細胞及物種限制
（5）可實現(xiàn)多個靶位點同時進行基因打靶
（6）功能豐富，可實現(xiàn)敲除、插入、抑制、激活等多種目的基因
4.CRISPR/Cas9敲除細胞系主要應用方向
CRISPR/Cas9敲除細胞系廣泛應用于許多領域，特別是在遺傳疾病治療、疾病相關基因的篩選和檢測、腫瘤治療、動植物轉(zhuǎn)化以及病原微生物的預防等領域具有巨大的潛力，可以有效改善人類的生活質(zhì)量。
5.CRISPR/Cas9敲除細胞系面對的挑戰(zhàn)
盡管之前的解釋表明 CRISPR/Cas9 是一種很有前途的方法，但這種編輯系統(tǒng)仍然存在許多局限性和風險，由于其最近在人類中的發(fā)現(xiàn)和使用，使其在臨床試驗中的使用具有挑戰(zhàn)性。免疫原性、脫靶、多態(tài)性、遞送技術和倫理問題是主要的限制和困難。
6.CRISPR/Cas9敲除細胞系的全流程介紹
CRISPR/Cas9敲除細胞系，主要流程如下：gRNA設計，細胞轉(zhuǎn)染，單細胞克隆，單克隆篩選，單克隆測序分析，交付報告。

 
 
6.1 gRNA設計
6.1.1用 BbsI 在 37℃條件下酶切載體質(zhì)粒 pAC1371。
6.1.2參照DNA 片段回收試劑盒說明書回收目的載體。
6.1.3引物退火
使用以下參數(shù)在 PCR 環(huán)儀中進行退火:

試劑	使用量
Oligo 1（100μM）	1.0
Oligo 2（100μM）	1.0
ddH2O	7.5
T4 PNK(NEB)	0.5
Total	10

 
37℃ 30 分鐘，95℃ 5 分鐘，然后以每分鐘降低 5℃的速度將溫度降到 25℃。
6.1.4連接酶連接。
6.1.5質(zhì)粒轉(zhuǎn)化（Transformation）
（1）取DH5a 感受態(tài)細胞放在冰上解凍，解凍后將5-10µL連接產(chǎn)物添加到感受狀態(tài)細胞中，用槍頭輕輕攪拌均勻(切勿劇烈震動)，在冰箱中靜置孵化25-30分鐘。
（2）將感受態(tài)細胞放入冰上孵化后，提前調(diào)節(jié)溫度至42℃的水浴鍋中，加熱90秒。
（3）加入 500μL 提前預熱至室溫的液體培養(yǎng)基，置于 37℃搖床中復蘇搖菌 1 小時。
（4）3000 轉(zhuǎn)離心 3 分鐘，棄掉部分上清液，用滅菌冷卻至室溫的玻璃棒涂板，置于 37℃培養(yǎng)箱中過夜生長。
（5）隨機挑取獨立生長的菌斑于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 6-8 小時，進行菌落 PCR。
（6）將 PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。凝膠成像儀成像，選取陽性菌落送去測序公司進行測序鑒定。
（7）根據(jù)測序結果選取目的菌落擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，備后續(xù)實驗室用。
 
6.2細胞轉(zhuǎn)染
6.2.1準備：細胞準備，將長勢良好 HEK293T 細胞按一定數(shù)量傳代。
6.2.2將長勢良好，密度適當?shù)?HEK293T 細胞更換一半新鮮培養(yǎng)基。
6.2.3 pMD2.G: 1µg+paspax2: 1µg +transgene: 2µg+optimem: 0.126mL 混勻，室溫靜置5 分鐘， lipofectamine 2000：8µL+optimem: 0.125mL 混勻，室溫靜置 5 分鐘。
6.2.4  5 分鐘后將步驟 5.2 .3中的兩種混合物輕柔的混合在一起，室溫靜置 15 分鐘。
6.3單細胞克隆
100 個細胞鋪在一個大盤或 96 孔板中。剩余的細胞凍存。當肉眼可見類似于菌落的細胞團時，將其從大盤或 96 孔板消化下來轉(zhuǎn)移至 12 或 24 孔板中繼續(xù)擴大培養(yǎng)。注意不要污染到其它細胞團，不要選取過密的細胞團。
6.4單克隆篩選
使用特定的篩選標記，如熒光蛋白或抗生素抗性基因，也可以幫助篩選成功敲除目標基因的克隆。
6.5單克隆測序分析
使用聚合酶鏈式反應（PCR）來擴增目標基因的DNA序列，并通過凝膠電泳或測序技術來檢測是否存在突變或缺失。