基因合成常見問題解答1

1、對于合成高難度的基因，需要如何解決的？

高低GC，重復(fù)結(jié)構(gòu)	使用像酶切鏈接、多段重組等方式，分成小段，來降低結(jié)構(gòu)對合成的影響。
序列較長	使用多端重組的方式來構(gòu)建，體外組裝與體內(nèi)組裝相結(jié)合。
特殊載體元件 （如CCDB等）	根據(jù)不同的特殊元件更換相對應(yīng)的特定感受態(tài)細胞。
其他不可預(yù)測的難度 （如有毒性）	嘗試不同的感受態(tài)細胞

2、在大腸桿菌表達系統(tǒng)中，哪種終止密碼子具有偏好性？
在大腸桿菌中，使用頻率是：TAA > TGA，TAG很少用。
3、在哺乳動物表達系統(tǒng)中，哪種終止密碼子具有偏好性？
在哺乳動物中，使用頻率是：TGA > TAA > TAG。
4、什么是密碼子偏好性？
密碼子偏好性是指不同的生物，對簡并密碼子使用頻率不相同。
5、什么是密碼子優(yōu)化？
密碼子優(yōu)化是一種通過增加靶基因的翻譯效率來提高生物體內(nèi)蛋白質(zhì)表達水平的技術(shù)。通常會通過避免稀有密碼子，利用偏愛密碼子，簡化mRNA的二級結(jié)構(gòu)，優(yōu)化重復(fù)序列，消除限制酶切位點，調(diào)整GC含量等方法重新設(shè)計基因，以提高翻譯效率，進而提高蛋白表達水平。
通常情況下，CAI < 0.80被認為需要進行密碼子優(yōu)化。
6、什么是CAI？
1980年代后期，科學(xué)家根據(jù)高表達基因的參考文獻中的密碼子使用頻率創(chuàng)建了密碼子適應(yīng)指數(shù)CAI。
7、COA中酶切驗證的酶切位點的選擇標準是什么？
酶切驗證是一種驗證質(zhì)粒是否正確的手段，驗證時的酶切位點優(yōu)先選擇首位位點；優(yōu)先選擇雙酶切，并且兩條帶的大小不一樣；當出現(xiàn)片段太小導(dǎo)致電泳圖不明顯，或者分離的條帶距離太近，不容易分開情況時，選擇最能表現(xiàn)質(zhì)粒本身特征的其他位點。
8、移碼現(xiàn)象是什么？在設(shè)計基因合成或亞克隆方案時如何避免移碼？
每三個堿基表達一個氨基酸，移碼現(xiàn)象是由于基因中增加或減少非三及三的倍數(shù)個堿基，會使得該位點后面的DNA序列產(chǎn)生移碼現(xiàn)象，導(dǎo)致表達出來的蛋白非目的蛋白。我們在設(shè)計方案時應(yīng)注意：
a. 酶切位點的選擇，如NcoI(CCATGG)，因為其含有一個起始密碼子，所以很容易發(fā)生移碼現(xiàn)象，因此，在使用這類酶切位點時應(yīng)慎重，可以添加移碼保護堿基；
b. 盡量利用載體上已有的序列。
9、什么類型載體的亞克隆難度比較大？
對于大載體、低拷貝載體、背景不清的載體、自殺性載體和特殊抗性載體，很難進行亞克隆。例如：pMG36e（紅霉素抗性）和pCYT（氯霉素抗性）等。
10、基因合成的成功率主要由什么決定？我們需要考慮哪些因素？
合成的成功概率主要由DNA結(jié)構(gòu)（重復(fù)序列、GC含量等因素）和宿主細胞穩(wěn)定性（毒性等因素）來決定。想要提高重組基因合成的成功概率需要考慮以下因素。
主要因素包括：
a. 整體GC含量過低（低于20％）或過高（高于80％）；
b. DNA序列中的各種GC含量；
c. 均聚物（如polyA)；
d. 重復(fù)序列長度≥20bp；
e. 小重復(fù)序列的個數(shù)以及長度；
f. 是否含有回文序列；
11、甲基化現(xiàn)象是什么？
甲基化現(xiàn)象是DNA化學(xué)修飾的一種形式，是一種表觀遺傳修飾，在不改變DNA序列的情況下，改變遺傳表現(xiàn)。
12、基因合成交付什么內(nèi)容？
（1）基因COA文件
（2）5µg凍干質(zhì)粒DNA
（3）質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖
（4）測序圖譜