肝纖維化病理狀態(tài)下組織駐留巨噬細(xì)胞的新幫手Kupffer細(xì)胞及作用機(jī)制

Science揭示巨噬細(xì)胞kupffer的新幫手，原來竟是他？！​

2023年的國自然熱點(diǎn)，巨噬細(xì)胞憑借822個中標(biāo)量榮登榜首，近三年的熱度也持續(xù)攀升。命運(yùn)圖譜模型（fate-mapping）、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)的不斷進(jìn)步推動了揭開組織駐留巨噬細(xì)胞神秘面紗的腳步。今年6月，F(xiàn)rederic Geissmann團(tuán)隊在nature發(fā)表了名為《Physiology and diseases of tissue-resident macrophages》，針對這些年組織駐留巨噬細(xì)胞的起源以及在不同組織或者生理過程中發(fā)揮的功能進(jìn)行總結(jié)（感興趣的伙伴可以點(diǎn)擊標(biāo)題閱讀原文）。九月，Paul Kubes團(tuán)隊找到了肝纖維化病理狀態(tài)下組織駐留巨噬細(xì)胞的新幫手及其具體機(jī)制，巨噬細(xì)胞的研究進(jìn)展如此可喜，快來和小優(yōu)一起看看吧！  

Kupffer細(xì)胞樣合胞體代償纖維化肝臟中常駐巨噬細(xì)胞的功能

文章概覽：
肝臟中的常駐巨噬細(xì)胞在與肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和星狀細(xì)胞組成的龕位中接受指令，進(jìn)而激活特定的轉(zhuǎn)錄因子，賦予其新身份：Kupffer細(xì)胞（KC）。在血竇中，KC向?qū)嵸|(zhì)細(xì)胞延伸偽足以保持其特性，充當(dāng)人體的中央細(xì)菌過濾器，并且通過補(bǔ)體受體CRlg在內(nèi)的特異性受體，發(fā)揮從血液中捕捉病原體的功能。肝纖維化和肝硬化的發(fā)展過程十分相似，均會涉及肝細(xì)胞死亡和肝竇周圍的膠原沉積導(dǎo)致血流重新分配到新的和擴(kuò)張的肝內(nèi)和肝外側(cè)支血管。然而在這種組織重塑過程中，KC如何適應(yīng)變化尚未可知。

在這項(xiàng)研究中，作者觀察、追蹤并功能性評估了肝纖維化狀態(tài)中的單核細(xì)胞和KC：在纖維化龕中失去與實(shí)質(zhì)細(xì)胞的接觸會導(dǎo)致竇狀駐留的KC失去特性和功能，而單核細(xì)胞會跟隨側(cè)支血管的形成繞過竇，在竇中形成類似KC的合胞體，表達(dá)KC細(xì)胞標(biāo)記，具有更強(qiáng)的捕捉細(xì)菌的能力，從而挽救并適應(yīng)肝纖維化狀態(tài)中下調(diào)的KC細(xì)胞的功能特性（圖1）。這些細(xì)胞結(jié)構(gòu)可能在進(jìn)化過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，使哺乳動物能夠承受肝臟中嚴(yán)重的慢性損傷。這項(xiàng)研究成果有望改進(jìn)肝纖維化患者的治療方案。 
 

圖1 肝纖維化中KC的適應(yīng)變化
 

主要結(jié)果：
01 Kupffer細(xì)胞的免疫監(jiān)視功能及肝纖維化的進(jìn)行性血管重塑
與其他免疫細(xì)胞不同的是，KC向?qū)嵸|(zhì)細(xì)胞（肝星狀細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞）延伸偽足，形成KC龕（圖2A-B），兩者之間的相互作用對于維持KC細(xì)胞的功能十分重要，這種生態(tài)位也是免疫監(jiān)視的最佳選擇，如小鼠感染葡萄球菌（MW2-GFP）后，KC能夠迅速捕獲細(xì)菌，并且為了KC能夠迅速占據(jù)大量竇腔，竇道會變得足夠狹窄（圖2C）。

圖2 Kupffer細(xì)胞的免疫監(jiān)視功能及肝纖維化的進(jìn)行性血管重塑 
 

02 肝纖維化改變了Kupffer細(xì)胞的生態(tài)位，導(dǎo)致其功能喪失
明確了KC的免疫監(jiān)視功能之后，作者接下來研究了在肝纖維化病理狀態(tài)下的KC生態(tài)位。與正常小鼠相比，CCl4建立的小鼠肝纖維化模型中，肝竇周圍有大量的膠原沉積，肝血流量也降低（圖3A-D），并且肝竇的直徑減小，KC的偽足也明顯減少（圖3E-F），不僅如此，與健康受試者相比，肝硬化（F4期纖維化）患者的KC平均數(shù)也降低（圖3G-H）。進(jìn)一步地，作者證實(shí)了KC與造血干細(xì)胞之間的共定位（圖3I）。感染金黃色葡萄球菌后，與對照組小鼠相比，肝纖維化小鼠肝竇中KC的細(xì)菌捕獲明顯減少，在捕獲細(xì)菌的竇液中，F(xiàn)4/80+巨噬細(xì)胞的比例也有所下降，同時血液及脾臟中的細(xì)菌負(fù)荷也明顯高于對照組（圖3J-L）。由于KC也能夠殺死捕獲的葡萄球菌，接下來作者對兩組小鼠KC的吞噬能力進(jìn)行測定，與對照組相比，CCl4處理后，對捕獲異物的酸化處理延遲了一個小時（圖3M），這表明，肝纖維化環(huán)境中KC的抗菌能力下調(diào)甚至喪失。 

圖3 肝纖維化改變了Kupffer細(xì)胞的生態(tài)位，導(dǎo)致其功能喪失 
 

03 肝纖維化導(dǎo)致Kupffer細(xì)胞特性喪失
由于纖維化肝竇中巨噬細(xì)胞喪失KC特性，作者接下來重點(diǎn)研究了賦予KC表型適應(yīng)性的兩個關(guān)鍵分子：免疫球蛋白超家族互補(bǔ)受體（CRIg）和T細(xì)胞膜蛋白4（TIM-4）。與對照組小鼠相比，CCl4處理后，表達(dá)TIM-4和/或CRIg的F4/80+巨噬細(xì)胞明顯減少，并且四種KC識別標(biāo)記物（CLEC2、CLEC4F、CRIg和TIM-4）的水平也顯著降低（圖4A-D）。在肝硬化患者的活檢組織中也觀察到了，IBA1+（IBA1可識別所有巨噬細(xì)胞）人肝竇巨噬細(xì)胞中CRIg的丟失（圖4L-M）。為了研究肝竇KC的發(fā)育，作者使用了Ms4a3cre×Rosatdtomato單核細(xì)胞命運(yùn)圖譜小鼠，其骨髓（BM）衍生的前體而非胎肝衍生的常駐巨噬細(xì)胞會發(fā)出熒光。穩(wěn)態(tài)條件下，肝竇中2-10%巨噬細(xì)胞來自BM來源的單核細(xì)胞。經(jīng)過8周的CCl4處理后，竇腔中約30%的巨噬細(xì)胞來自BM來源的單核細(xì)胞，70%來自胎肝來源的KC，（圖4E-F）。將來源于BM的Ms4a3+F4/80+細(xì)胞和來源于胎肝的Ms4a3-F4/80+細(xì)胞分類為表達(dá)CRIg和TIM4的細(xì)胞，結(jié)果顯示這些標(biāo)記在胎肝細(xì)胞和來源于BM的細(xì)胞中的比例相似，這表明KC在纖維化過程中正在發(fā)生去分化（圖4G）。
此外，F(xiàn)4/80+CRIg+TIM-4+細(xì)胞的Ms4a3比例最低，但F4/80+CRIg+TIM-4-細(xì)胞和F4/80+CRIg-TIM-4-細(xì)胞的單核細(xì)胞替代率低于50%（圖4H）。8周的CCl4處理后，宿主CK也降低了10%左右（圖4I）。Clec4fcre-nTdTomato×Rosa26ZsGreen小鼠中，竇道中超過95%的F4/80+細(xì)胞共表達(dá)了tdTomato和ZsGreen，表明KC表型活躍，然而CCl4處理后，肝竇中存在三種F4/80+細(xì)胞亞群：tdTomato+ZsGreen+KCs、tdTomato-ZsGreen+前KCs（exKCs）和無CLEC4F表達(dá)的F4/80+細(xì)胞（圖4J）。這表明KC細(xì)胞下調(diào)的標(biāo)記物，除了CRIg和TIM4，還有CLEC4F。并且，CCl4處理后ZsGreen+tdTomato+F4/80+KC的細(xì)菌捕獲能力更強(qiáng)（圖3K）。這表明，即使在纖維化過程中，也需要KC表型來捕獲細(xì)菌。

圖4 肝纖維化導(dǎo)致Kupffer細(xì)胞特性喪失
 

04 纖維化中出現(xiàn)多核合胞體，Kupffer細(xì)胞特征增強(qiáng)
既然在纖維化過程中，也需要KC表型來捕獲細(xì)菌，而事實(shí)情況也是大多數(shù)細(xì)菌仍能夠在肝纖維化過程中被有效捕獲（圖3K），那么肝臟的適應(yīng)變化是什么樣的呢？作者發(fā)現(xiàn)，CCl4處理后，感染葡萄球菌的小鼠存活率僅有微小差異，然而消耗小鼠的巨噬細(xì)胞或者KC后感染細(xì)菌將導(dǎo)致100%或80%的死亡率（圖5A-B）。更有意思的是，CCl4處理后，在側(cè)支血管形成了大量的F4/80+巨噬細(xì)胞聚集，偶爾能看到單個巨噬細(xì)胞（圖5C），這些巨噬細(xì)胞集落平均捕獲的葡萄球菌在30個左右，并且都表達(dá)高水平的CRIg（圖5D）。與野生型小鼠相比，CRIg-/-小鼠在CCl4處理8周后也會形成巨噬細(xì)胞聚集，但無法捕獲細(xì)菌（圖5G），并且在靜脈注射金黃色葡萄球菌MW2后，小鼠肝臟中的菌血癥增加，肝臟CFU（colony-forming units）減少（圖5H）。側(cè)支血管中的巨噬細(xì)胞集落也能夠迅速酸化葡萄球菌生物顆粒，其動力學(xué)與KC相似，巨噬細(xì)胞集落從高流量血管中高效清除細(xì)菌的能力因肝臟血流的機(jī)械性減少而急劇下降，并在血流恢復(fù)正常后迅速恢復(fù)（圖5I-J）。因此，表達(dá)CRIg的巨噬細(xì)胞集落的出現(xiàn)將纖維化肝臟的捕獲能力從肝竇轉(zhuǎn)移到了側(cè)支靜脈。
高分辨率顯微鏡（圖5K）和透射電子顯微鏡（TEM）（圖5L）顯示在小鼠纖維化肝臟中發(fā)現(xiàn)了多核巨型巨噬細(xì)胞，表明在某些情況下這些細(xì)胞會融合成巨型細(xì)胞，作者將這些命名為“Kupffer細(xì)胞樣合胞體”。不僅如此，作者在不同病因的肝硬化患者組織中發(fā)現(xiàn)了大量的CD68+多核巨細(xì)胞集落，這些KC樣合胞體也呈CRIg陽性（圖5M-O）。 

圖5 纖維化中出現(xiàn)多核合胞體，Kupffer細(xì)胞特征增強(qiáng)

05 合胞體具有Kupffer細(xì)胞表型，并且來源于骨髓
合胞體除了具有超強(qiáng)的細(xì)菌捕獲能力、高度表達(dá)CRIg之外，還表達(dá)TIM-4和CLEC4F，盡管具有KC表型，但約90%的合胞體表達(dá)Ms4a3，這也表明合胞體主要來源于單核細(xì)胞（圖6A-D）。CCl4處理2周時，表達(dá)CX3CR1的單核細(xì)胞在大血管內(nèi)廣泛募集，并開始表達(dá)F4/80，4周時達(dá)到巔峰，但在竇內(nèi)沒有募集，而缺乏CX3CR1的KC則位于周圍的竇道中，這表明，肝纖維化過程中招募的單核細(xì)胞而非更早時期是KC樣合胞體的來源。使用PKH標(biāo)記常駐巨噬細(xì)胞，8周的CCl4處理后，竇狀KC可被標(biāo)記，而合胞體不會，這說明竇狀KC不是合胞體的來源（圖6E-I）。

圖6 合胞體具有Kupffer細(xì)胞表型，并且來源于骨髓 
 

06 Kupffer細(xì)胞樣合胞體通過CD44和共生微生物被招募
細(xì)菌從腸道轉(zhuǎn)移是人類肝硬化的一個特征。相比較對照小鼠，從出生起就接受抗生素治療的小鼠或者無菌小鼠，在CCl4處理后，合胞體形成顯著減少（圖7A-B），此外，靜脈注射金黃色葡萄球菌也會減少兩種小鼠肝臟對細(xì)菌的捕獲，并增加血液中的細(xì)菌數(shù)量（圖7C-F），經(jīng)CCl4處理的Myd88-/-小鼠（對細(xì)菌感染的敏感性增加）也表現(xiàn)出較少的合胞體形成（圖7G）。合胞體從骨髓招募到側(cè)支血管的具體機(jī)制是怎樣的呢？作者通過分析最近發(fā)表的CCl4纖維化模型以及人類肝硬化中單核巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，找到了在細(xì)胞融合與粘附過程中上調(diào)的一些關(guān)鍵基因：CD9、CD36和CD44，同時CD44是肝臟中多種類型細(xì)胞的主要粘附機(jī)制。CCl4處理后，CD44-/-小鼠側(cè)支血管中單核細(xì)胞數(shù)量顯著減少，8周后甚至沒有KC樣合胞體的形成。不僅如此，骨髓派生的CD44而非實(shí)質(zhì)細(xì)胞CD44是KC樣合胞體形成的必要條件（圖7I-L）。與野生型小鼠相比，經(jīng)CCl4處理后，CD44-/-小鼠肝臟的細(xì)菌捕獲能力明顯降低，纖維化肝臟中的CFU數(shù)量減少了三分之一，并且存活率也更低。獲得了骨髓派生的KC合胞體的小鼠表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)菌捕獲能力并減少了菌血癥（圖7M-Q）。更有意思的是，未被細(xì)菌感染的野生小鼠和CD44-/-均存活，也就意味著非病理狀態(tài)下，不涉及KC樣合胞體的形成（圖7Q）。這些結(jié)果證明了：Kupffer細(xì)胞樣合胞體從骨髓招募到側(cè)支血管依賴于CD44和共生微生物。
 

圖7 Kupffer細(xì)胞樣合胞體通過CD44和共生微生物被招募 

細(xì)胞融合與粘附過程中的關(guān)鍵基因除了CD44還有CD9和CD36，作者接下來研究了CD9和CD36是否參與其中�？笴D9阻斷抗體對CCl4處理后小鼠合胞體沒有影響，CD36-/-小鼠在CCl4處理后未能形成合胞體，但是側(cè)支血管中有大量CRIg+F4/80+細(xì)胞，這表明CD36-/-單核細(xì)胞被招募，但未能形成合胞體，而是以分散的單個巨噬細(xì)胞的形式出現(xiàn)，并且與KC樣合胞相比，單個巨噬細(xì)胞在絡(luò)脈中所占的體積要小得多（圖8A-C）。作者同樣也證明了只有骨髓派生的CD36才是KC樣合胞體形成的必要條件（圖8D）。經(jīng)CCl4處理的CD36-/-小鼠的巨噬細(xì)胞盡管高度表達(dá)CRIg，但是缺乏在較大血管中捕獲細(xì)菌的能力，小鼠的存活率也較低。同樣地，獲得了骨髓派生的KC合胞體的小鼠表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)菌捕獲能力以及清除能力（圖8E-I），這些結(jié)果也證實(shí)了Kupffer細(xì)胞樣合胞體的粘附和融合依賴于CD36。  

圖8 Kupffer細(xì)胞樣合胞體依賴于清道夫受體CD36進(jìn)行細(xì)胞粘附和融合 
 

全文總結(jié)
作者的研究結(jié)果表明，KC在肝臟處于病理狀態(tài)下（如肝纖維化）由于自身生態(tài)位的改變，會失去巨噬細(xì)胞特性及其在肝竇內(nèi)捕捉細(xì)菌的功能。肝臟針對這種變化做出的適應(yīng)性改變是：招募骨髓中的單核細(xì)胞到側(cè)支血管，賦予其KC功能，并且單核細(xì)胞聚集形成KC樣合胞體，具備更高的細(xì)菌捕獲及清除能力。具體機(jī)制是：肝臟中微生物或者微生物產(chǎn)物的增加以及血管中的高剪切力導(dǎo)致單核細(xì)胞被CD44募集，進(jìn)而形成KC合胞體，同時依賴于CD36進(jìn)行細(xì)胞粘附和融合。