干細胞的定義和特性、分類及其培養(yǎng)和應用
干細胞 (Stem cell，SC) 的定義和特性
干細胞 (Stem cell，SC) 是指在多細胞生物體發(fā)育的早期階段產生的一類具有自我更新能力，并可分化為多種細胞譜系的細胞 (分化潛能)。干細胞在一定條件下可以分化成為各種不同的組織細胞，進一步可培養(yǎng)形成人體各種組織和器官 (圖 1)。目前，干細胞在細胞治療、器官移植、神經(jīng)退行性疾病建模和藥物篩選等領域得到廣泛應用亡[1,2]。
圖 1. 干細胞：主要描述干細胞可根據(jù)起源和分化潛能對干細胞進行分類。
干細胞的分類
■ 根據(jù)干細胞來源劃分
胚胎干細胞 (ESCs)：胚胎干細胞 (ESCs) 由于其再分化的能力遠高于成體干細胞，擁有分化為三個胚層的細胞的多種分化潛能[3]。
Tips: 外胚層可主要形成表皮和神經(jīng)系統(tǒng)，中胚層進一步發(fā)育為體內的真皮、肌肉、骨骼及其他結締組織和循環(huán)系統(tǒng)，內胚層進一步形成各類器官的上皮組織。成體干細胞 (ASCs)：是體細胞或組織特異性干細胞，也是未分化的細胞，在發(fā)育后的身體各部分中存在，具備分化為體內各種細胞的潛能。
Tips: 成體干細胞通過細胞分裂增殖的方式補充死亡細胞，并能使受損的組織再生，其中包括：造血干細胞 (HSCs)，生殖干細胞 (GSCs)，間充質干細胞 (MSCs)，神經(jīng)干細胞 (NSCs)，視網(wǎng)膜干細胞 (RSCs)，心臟干細胞 (CSCs) 等細胞類型。
圖 2. 成體干細胞：主要描述了成體干細胞在人體內的主要類型和終端分化方向
■ 根據(jù)分化潛能劃分
全能干細胞(Totipotent stem cells) 的全能性是指具有潛能生成組成胚胎以及支持胚胎在子宮生長發(fā)育的全部細胞和組織，并能繼續(xù)分化一直生長為一個成熟個體[4]。
多能干細胞 (Pluripotent stem cells) 如 ESCs，可以分化為三個胚層的胚胎干細胞，包括胚泡內細胞團來源和胚胎生殖嵴生殖細胞來源的干細胞。與全能干細胞的區(qū)別在于無法分化為胚胎外組織細胞 (如滋養(yǎng)層形成的胎盤和臍帶組織) 的能力。
誘導多能干細胞 (iPSCs) 又稱人工誘導多能干細胞，是一種由哺乳動物成體細胞經(jīng)轉入轉錄因子，如 SOKM (Sox2、Oct4、Klf4 和 c-Myc) 組合使體細胞重新編程回到多能干細胞狀態(tài)[5,6]。
成體多能干細胞和寡能干細胞這些細胞的分化潛能稍次于多能干細胞 ESCs。成體多能干細胞 (Multipotent stem cells)：如造血干細胞可進一步分化形成體內血小板和紅細胞 (圖 3)。單能干細胞 (Unipotent stem cells) 只能向一種類型的細胞分化，其發(fā)育潛能最低。
圖 3. 造血干細胞的分化[7]。
巨核造血和紅細胞生成的分化途徑。巨核細胞生成的典型特征是細胞大小成倍的增加，導致最后胞體延伸，長出“假肢”(血小板)，隨后將血小板釋放到血液中。紅細胞生成過程需要經(jīng)歷幾個形態(tài)和結構的變化，最后產生嗜堿、嗜多色和嗜酸的紅細胞。直到終端成熟期結束，網(wǎng)狀細胞被釋放到血液中，才完成對成熟紅細胞的成熟。
MK：巨核細胞；HSC：造血干細胞；CMP：普通髓系祖細胞；MEP：巨核細胞-紅細胞祖細胞。
干細胞的培養(yǎng)與應用
干細胞培養(yǎng)所需的細胞因子主要屬于轉化生長因子-β 超家族和集落刺激因子兩大類別。
轉化生長因子-β 超家族 (TGF-βs)：由近 30 個成員組成，其中包括 TGFβ (TGF-β1、TGF-β2 和 TGF-β3)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (BMP)、激活素 (Activin A) 和抑制素 (Inhibin)等。受體分為兩大類 (I 型和 II 型)，都是絲氨酸-蘇氨酸激酶。I 型受體的激活導致各種 Smads 蛋白的磷酸化，這些蛋白易位至細胞核并激活靶基因的轉錄。II 型受體的激活主要促進 ERK、JNK 和 p38 MAPK 激酶等信號通路[8,9]。
常用的培養(yǎng)因子如 BMP-4 和激活素 A (Activin A) 在細胞的生長和分化過程中發(fā)揮重要作用[10]。
集落刺激因子 (CSFs)：包括巨噬細胞集落刺激因子 (M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子 (GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子 (G-CSF) 和多能集落刺激因子 (multi-CSF/IL-3)，它們被廣泛用于促進血細胞發(fā)育和分化。廣義上講，所有能夠刺激造血過程的細胞因子都可以統(tǒng)稱為 CSF，例如刺激紅細胞生成的促紅細胞生成素 (EPO)、刺激造血干細胞生成的干細胞因子 (stem cell factor，SCF)、刺激胚胎干細胞的生成的白血病抑制因子 (Leukemia inhibitory factor，LIF) 等。
圖 4. 用于體外產生血小板和紅細胞的可溶性細胞因子[7]
干細胞需要生長因子和營養(yǎng)物質共同作用來保持分化和發(fā)育。例如，科學家已經(jīng)可以使用重組蛋白實現(xiàn)在體外誘導 HSCs 的分化，產生紅細胞和血小板，并研究出最佳的培養(yǎng)條件，以最大限度地提高每一個巨核細胞產生的血小板產量，以及提高在體外獲得的帶核紅細胞的數(shù)量。
重組人 TPO 常用于生成巨核細胞。血小板成素及其類似物與多種細胞因子結合，包括干細胞因子和白細胞介素 (例如 IL-3、IL-6、IL-11)，在它們的共同作用下促進造血干細胞產生成熟巨核細胞群，進而形成血小板，同時無需補充血清或與飼養(yǎng)細胞共培養(yǎng)[11][12]。
華中科技大學同濟醫(yī)學院袁教授團隊通過體外和體內模型證明了聯(lián)合應用吡咯替尼(Pyrotinib) 和阿帕替尼 (Apatinib) 治療 ER2 陽性 GC (Gastric Cancer) 具有協(xié)同作用，通過 RNAseq、KEGG 數(shù)據(jù)庫和 Western-blot 等實驗分析 NCI-N87 和 NCI-N87-AR (耐 Pyrotinib) 細胞中 SCF 的表達水平存在差異，發(fā)現(xiàn)不同濃度 SCF 通過激活 PI3K/AKT 和 MAPK 信號通路是產生獲得性吡咯替尼耐藥的潛在機制，從而為 HER2 陽性 AGC (Advanced Gastric Cancer) 患者的臨床研究奠定基礎。
圖 5. 用不同濃度的SCF (Purchased from MedChemExpress) 處理 NCI-N87 細胞時，無論是否添加了 Pyrotinib，SCF/c-kit 的表達以及下游的 PI3K/AKT 和 MAPK 途徑蛋白表達都以劑量依賴的方式上調[13]。
MCE 提供多種干細胞研究所用的具有高純度、高活性重組蛋白、細胞因子以及小分子化合物。
表 1：各類干細胞培養(yǎng)和誘導分化常用的人源細胞因子
|
蛋白/ 細胞因子 |
造血 干細胞 (HSC) |
胚胎 干細胞 (ESC) |
神經(jīng) 干細胞 (NSC) |
誘導性多能 干細胞 (iPSC) |
間充質干細胞 (MSC) |
| √ | √ | √ | √ | √ | |
| EGF | √ | √ | √ | √ | √ |
| TGF-β1 | √ | √ | √ | ||
| TGF-β3 | √ | ||||
| BMP-4 | √ | √ | √ | ||
| Activin A | √ | ||||
| IL-3 | √ | √ | |||
| SCF | √ | ||||
| Flt3-ligand | √ | ||||
| GM-CSF | √ | ||||
| G-CSF | √ | ||||
| M-CSF | √ | ||||
| LIF | √ | √ | |||
| TPO | √ | ||||
| VEGF165 | √ | ||||
| FGF-8b | √ | ||||
| IL-6 | √ | ||||
| SHH | √ | ||||
| CNTF | √ | √ | |||
| Noggin | √ | ||||
| PDGF-BB | √ | ||||
| R-spondin 1 | √ | ||||
| HGF | √ | ||||
| Vitronectin | √ | √ |
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參考文獻
1. Tabansky, Inna, and Joel N. H. Stern. “Basics of Stem Cell Biology as Applied to the Brain.” Stem Cells in Neuroendocrinology, edited by Donald Pfaff et. al., Springer, 27 July 2016.pp. 11–24. doi:10.1007/978-3-319-41603-8_2
2. Rathnam, Christopher, et al. "Hybrid SMART spheroids to enhance stem cell therapy for CNS injuries." Science advances 7.40 (2021): eabj2281.
3. Shah, A.A., Khan, F.A. (2021). Types and Classification of Stem Cells. In: Khan, F.A. (eds) Advances in Application of Stem Cells: From Bench to Clinics. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, vol 69. Humana, Cham. https://doi.org/10.1007/978-3-030-78101-9_2
4. Chan, A W et al. “Clonal propagation of primate offspring by embryo splitting.” Science (New York, N.Y.) vol. 287,5451 (2000): 317-9. doi:10.1126/science.287.5451.317
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