細胞培養(yǎng)過程檢測支原體污染方法詳述

由于細胞支原體污染的隱蔽性及對細胞的嚴重影響，細胞的支原體污染已經(jīng)成為了一個比較棘手的世界性難題。實驗室新引進的細胞，應該比較采取一定的方法檢測確定沒有支原體污染才能使用。

1、培養(yǎng)法

培養(yǎng)法是最傳統(tǒng)的支原體污染檢測方法，也是最早的檢測方法，基本實驗步驟首先是將細胞培養(yǎng)物置于支原體肉湯液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3天后離心，將沉淀物轉(zhuǎn)移至支原體固體瓊脂培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基中若有類似煎雞蛋樣菌落出現(xiàn)，則細胞被支原體污染了。培養(yǎng)法簡單直觀，大多數(shù)支原體可出現(xiàn)特有的典型菌落，但是支原體生長緩慢，培養(yǎng)一代大3-4小時，一般需要培養(yǎng)28天才能判斷是否有支原體的污染，工作量大，而且有進一步擴大支原體傳播的風險。支原體對培養(yǎng)條件比較苛刻，培養(yǎng)基成分質(zhì)量或批次的不同都會對支原體的正常生長產(chǎn)生影響，而且有一些支原體無法通過培養(yǎng)法生長，因此使用培養(yǎng)法檢測結(jié)果并不準確容易產(chǎn)生假陰性。為了減輕支原體培養(yǎng)法的工作量，縮短檢測時間，需要一種快速簡單的檢測方法阻止支原體污染的擴散，出現(xiàn)了使用DNA熒光染色法檢測支原體的方法。

2、DNA熒光染色法

DNA熒光染色法是利用熒光試劑Hoechst 33258等標記細胞和支原體DNA，熒光染料會結(jié)合到DNA的A-T富集區(qū)域，因為支原體DNA中A-T含量占多數(shù)，所以可將其染色，染料在紫外光激發(fā)下產(chǎn)生黃綠色熒光，利用熒光顯微鏡觀察支原體是否存在。正常細胞核區(qū)見邊緣整齊清晰的熒光，胞質(zhì)區(qū)無熒光。被支原體污染的細胞不僅在細胞核而且在細胞核外及細胞膜上均可見許多大小均一之熒光小點，即為支原體DNA，證明細胞被支原體污染了。由于該方法不需要培養(yǎng)支原體，只需要用熒光顯微鏡觀察，操作較為簡便，檢測快速。但是該方法靈敏度比較低，因背景熒光的存在，細胞輕度支原體污染不易檢出。細胞裂解死亡產(chǎn)生碎片也會被熒光染料染色被誤認為是支原體染色所致造成假陽性。DNA熒光染色法比細胞培養(yǎng)法檢測縮短了檢測時間但靈敏度和準確性不高且檢測時需要熒光顯微鏡。熒光染色法不能確定具體是哪種支原體導致的細胞污染。熒光染色法一般要求培養(yǎng)無污染的指示細胞作為對照，增加了檢測的工作量。

鑒于DNA熒光染色法的不足之處，出現(xiàn)了靈敏度和準確性更高的PCR（Polymerase Chain Reaction）檢測支原體方法，Remy Teyssoud等以支原體的16SrRNA核酸序列中高度保守序列設計引物，采用PCR的方法檢測細胞中的支原體污染。支原體作為一種原核生物，其rRNA基因是由保守和多變序列間隔排列而成，能夠作為生物分類的指標。PCR以4種dNTP為底物，在引物存在的情況下，在DNA模板的3’末端進行互補鏈的延伸，多次反復的循環(huán)能使微量的模板核酸得到指數(shù)級的擴增。PCR檢測方法尤其適用于培養(yǎng)困難而且耗時的支原體的檢測鑒定。

3、PCR法：

PCR法檢測支原體基本步驟包括提取待測細胞上清，在PCR總反應體系中加入PCR緩沖液、氯化鎂、Taq酶、dNTP、模板和引物，設置擴增條件擴增反應。取微量擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用紫外檢測儀觀察并用凝膠成像系統(tǒng)照相，觀察是否有目的片段出現(xiàn)。PCR方法由于引物設計特異性較強，可以進行種屬的鑒別。比常規(guī)培養(yǎng)法檢測時間大大縮短，比DNA熒光染色法具有較高的特異性，能夠鑒別支原體的不同種。PCR產(chǎn)物的分析一般采用瓊脂糖凝膠電泳分析，初步判斷PCR產(chǎn)物片段的大小與預計是否一致。但最令人頭痛的問題是PCR 擴增產(chǎn)物污染，因為PCR 產(chǎn)物拷貝量大，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。最可能造成PCR 產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染，在操作時比較劇烈地搖動反應管，尤其是打開反應管的蓋進行電泳點樣操作時都可形成氣溶膠而污染。一個氣溶膠顆粒包含大量拷貝，因而由氣溶膠造成的污染產(chǎn)生的假陽性是一個值得特別重視 的問題，而且PCR一次只能檢測一個指標。隨著分子生物學的發(fā)展，逐漸發(fā)展了利用熒光定量PCR技術(shù)進行支原體檢測手段，如Melanie Stormer等利用熒光定量PCR方法快速檢測細胞中的支原體污染。

4、熒光定量PCR法：

熒光定量PCR法( realtime fluorescence quantitative PCR)是1996年由美國Applied Biosystems 公司推出的一種核酸新定量試驗技術(shù)，熒光定量PCR是在常規(guī)PCR基礎上加入熒光探針或相應的熒光染料來實現(xiàn)實時定量的。隨著PCR反應的進行，PCR反應產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一次熒光信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線。在實時熒光定量PCR技術(shù)中Ct值是指每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

實時熒光定量PCR檢測支原體主要的步驟包括支原體特異引物和探針的設計，陽性標準品的制備及標準曲線的繪制，熒光定量PCR特異性實驗，敏感性實驗和重復性實驗，最后是用待測細胞上清液上機檢測，通過Ct值及擴增曲線判斷。隨著實時熒光定量PCR的使用，出現(xiàn)了很多利用此技術(shù)檢測支原體的研究，Lorenzon S等利用熒光定量PCR方法檢測肺炎支原體capripneumoniae等，2017年Gerlier等發(fā)明了利用熒光定量PCR檢測支原體的專利。實時熒光定量PCR簡化了操作步驟，采用閉管檢測可避免PCR跑膠導致的氣溶膠假陽性的出現(xiàn)，敏感性高，可以實現(xiàn)實時監(jiān)控，還可以實現(xiàn)定量判斷。實時熒光定量PCR具有比PCR檢測快，靈敏度高的優(yōu)勢，尤其適合樣品模板含量較低時使用，實時熒光定量PCR能通過溶解曲線能夠判斷特異性擴增。實時熒光定量PCR需要配套價格高昂的熒光定量PCR儀器，而且設備維護費用高，機器設置操作復雜，需專業(yè)人員，難以得到全面推廣。

環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)是一種新興的基因擴增技術(shù)，由日本學者Notomi 2000年在Nucleic AcidsRes雜志上公開發(fā)表，作為一種分子生物學檢測技術(shù)，現(xiàn)先已廣泛應用于分子檢測領域，2005年Saito R等人發(fā)表了LAMP法快速檢測肺炎支原體的文章。2014年HEYing等用LAMP方法快速檢測capripneumoniae支原體，2016年美國Jonas M等發(fā)明了利用LAMP方法檢測肺炎支原體的專利。 2016年曹振發(fā)明了一種檢測廣譜支原體的LAMP方法的專利。2017年Matsuzaki I等使用LAMP用于基因轉(zhuǎn)移的快速檢測。LAMP原理是針對靶基因的6個區(qū)域設計4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(如Bst 酶)的作用下，水浴鍋中63℃左右，60分鐘即可實現(xiàn)109～1010倍的核酸擴增，具有很高的擴增效率，操作簡單，檢測不需要使用特殊的儀器。LAMP雖然增加了擴增效率，但引物間的非特異性配對容易導致假陽性結(jié)果，限制了LAMP方法的使用。

由于實時熒光定量PCR需要配套的儀器，且操作復雜，需要有經(jīng)驗的實驗人員對檢測結(jié)果進行分析，而LAMP法會出現(xiàn)假陽性問題，使實時熒光定量PCR和LAMP法在檢測支原體污染上都存在一定的弊端，為了尋求一種使用簡單，結(jié)果準確支原體檢測方法，出現(xiàn)了利用支原體酶這一特定活性檢測支原體的ATP酶法，如Lonza公司推出的商品化的Mycoalert支原體檢測試劑盒，ATP酶法是采用生物發(fā)光的原理，檢測支原體酶活性，其檢測的支原體酶廣泛存在于180多種支原體中，而這種酶不存在于真核細胞中。當支原體被裂解后，釋放的酶與反應底物發(fā)生催化反應，將ADP轉(zhuǎn)化成ATP，通過熒光分光光度計測量樣品中添加底物前后ATP的含量，可以得到一個比率，該比率指示支原體是否存在。如果這些酶不存在，第二次讀數(shù)相對于第一次讀數(shù)就沒有增加，如果酶與底物進行特異性反應，就會導致ATP含量上升。ATP含量的上升通過生物發(fā)光化學反應可以檢測到，讀數(shù)上升表明存在支原體污染。

5、ATP酶法

ATP酶法能夠檢測的支原體種類比較全，檢測結(jié)果能夠量化，容易判斷，耗時短，整個實驗過程需要20分鐘左右。由于ATP酶法主要依賴支原體酶活性的發(fā)揮，任何影響酶活性的發(fā)揮都有可能影響結(jié)果的準確性，2015年Vahid Molla Kazemiha等研究發(fā)現(xiàn)ATP酶法的靈敏度和準確性要低于實時熒光定量PCR法，ATP酶法需要使用熒光分光光度計，且商品化的支原體檢測試劑盒價格昂貴，大面積推廣使用成本較高，作者通過比較實時熒光定量PCR、和ATP酶法可以看出，基于核酸擴增檢測支原體的方法在其靈敏度和準確性上仍是支原體快速篩選檢測的首要手段。

恒溫擴增技術(shù)因其操作簡單、儀器控溫容易實現(xiàn)已作為微生物快速檢驗的最重要的手段之一。目前在工業(yè)和科研領域最為常見的恒溫擴增技術(shù)包括LAMP(Loop-mediated isothermal amplification method)和RPA（Recombinase polymerase amplification）。其中，RPA在擴增時間、擴增特異性、擴增所需要的能耗等方面均具有明顯的優(yōu)勢。原理為通過反應體系中通常為30-35個堿基的兩條特異性引物與重組酶形成復合物，在模板DNA上尋找同源序列發(fā)生鏈交換，并在DNA聚合酶作用下發(fā)生延伸。經(jīng)過上下游引物在模板的特異性區(qū)段兩端分別結(jié)合延伸，循環(huán)往復發(fā)生指數(shù)級擴增。擴增產(chǎn)物雖然可通過添加sybr Green染料實現(xiàn)熒光信號的增加，但因熒光染料無法區(qū)分非特異性，而通過反應體系中增加可以被核酸外切酶III或者核酸內(nèi)切酶IV進行堿基類似物切除的方式的特異性熒光探針技術(shù)進行檢測，從而大大提高了檢測的特異性。目前RPA核酸檢測技術(shù)現(xiàn)已應用到農(nóng)業(yè)，獸醫(yī)，生物制藥等多個領域。Boyle等人研究發(fā)現(xiàn)RPA對于HIV-1的診斷是一個理想的技術(shù)，不需要復雜的溫度循環(huán)設備，在恒定溫度條件下20min內(nèi)可以完成目的基因的擴增，對于HIV-1前病毒NDA檢測靈敏度可低至3個拷貝。目前RPA技術(shù)已經(jīng)在多個傳染病病原和微生物檢測領域得以廣泛的報道，如用于致病性支原體或是某種病毒等的檢測，但報道均為針對一種或完全同一類的病原進行檢測，截止目前利用RPA技術(shù)檢測細胞支原體污染的相關研究尚未見有報道。而支原體檢測需要跨不同的物種進行檢測，并且從進化樹親緣關系上，與支原體檢測需要包含的物種如萊氏無膽甾原體其基因序列和大腸桿菌同源性更高，需要排除大腸桿菌的干擾同時包含萊氏無膽甾原體。因此通過常規(guī)序列同源性分析，無法在上述兩條引物與探針之間設計特異性區(qū)段能夠在同源性上既能包括常見的支原體污染類型，又能排除大腸桿菌序列。

先達基因（gendx.cn）自主研發(fā)的ERA恒溫核酸擴增技術(shù)，通過酶工程改造，將來源于細菌和病毒的特定工具酶進行改造突變并篩選其功能，通過不同的DNA擴增反應體系進行優(yōu)化組合，從而獲得8種酶蛋白為核心的等溫擴增體系。配好的反應體系在各種實時熒光定量儀或者先達基因自主研發(fā)的簡易恒溫熒光檢測儀中，可實現(xiàn)恒溫擴增與熒光信號檢測于一體，通過實時熒光擴增曲線在20min內(nèi)就可通過檢測儀的顯示屏讀出檢測結(jié)果，檢測過程無需開蓋，避免氣溶膠的產(chǎn)生，結(jié)果可靠性大幅度提高。ERA結(jié)合先達基因提供的一步法提取DNA的試劑，進一步簡化了支原體檢測操作，5min完成細胞液的DNA提取，20min完成支原體DNA分子檢測，整個過程只需30min。

ERA中的擴增酶具有較強的錯配容忍性，而針對3’末端的錯配將大大影響擴增的效率。通過在探針序列中，在堿基類似物兩端待排除序列引入錯配，從而通過特異性擴增的引物及和特異性剪切的探針組合，達到擴增特異性的檢驗目的�；�于以上原則設計ERA上下游引物，引物在3’末端與大腸桿菌至少有一個堿基的錯配，但與所有支原體3’末端并無錯配，雖然在5’端與中間有個別堿基錯配，但并不影響其擴增；并設計特異性的探針區(qū)段，在堿基類似物兩端在待排除序列引入錯配，從而通過特異性擴增的引物及和特異性剪切的探針組合。

綜上所述，截止目前很多支原體檢測方法已被開發(fā)出來，并多種檢測試劑盒可供選擇，但是這些方法或是因為敏感性差容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，或是因為檢測范圍小不能檢測到所有的支原體污染，或是因為試驗周期長費時費力。先達基因研發(fā)的恒溫廣譜支原體檢測試劑盒，基于其實時熒光恒溫核酸檢測技術(shù)（ERA），可以在恒定的低溫下（25℃-42℃）對痕量的支原體種內(nèi)保守性DNA片段進行特異性的擴增，擴增反應可以在20min內(nèi)完成，實現(xiàn)了快速簡單靈敏的進行細胞支原體常規(guī)檢測，較其他的方法更加實用有效。