利用小型有機染料納米團簇提升 NIR-II 成像引導的手術效果
本文要點：通過熒光引導手術（FGS），可以大大提高實體瘤患者的手術準確性。然而，現(xiàn)有的FGS技術由于其低穿透深度和靈敏度/選擇性而存在局限性，這在相對較短的成像窗口（<900 nm）中尤為普遍。使用近紅外二區(qū)（NIR-II）FGS，通過在長成像窗口（>900 nm）下的低自發(fā)熒光和散射，可以有效解決這些問題。然而，有機染料固有的自組裝性導致材料在主要器官大量積累，導致明顯的背景信號和潛在的長期毒性。
本文基于供體-受體-供體的染料的供體結構，以控制自組裝過程。最終控制形成超小染料納米團簇，從而促進腎臟排泄并最大限度地減少背景信號。該染料納米團簇不僅可以顯示清晰的血管成像、腫瘤和腫瘤前哨淋巴結的定位，還可以實現(xiàn)腫瘤陽性前哨淋巴結的高性能NIR-II成像引導手術。通過這項研究表明，基于染料納米團簇的 NIR-II FGS 顯著改善了根治性淋巴結清掃術的結果。
這項研究的目標是通過合理地設計供體結構，來控制S-D-A-D-S染料的組裝過程。研究結果表明，將己基叔（乙二醇）鏈連接到呋喃供體會導致 S-D-A-D-S 染料組裝成小的納米團簇。這些染料納米團簇可以通過腎臟迅速排泄，并且不會積聚在肝臟和骨髓等免疫器官中。染料納米團簇提供高性能的NIR-II血管造影和淋巴造影。它們還能夠實現(xiàn)高性能的 NIR-II 成像引導手術，使腫瘤相鄰的前哨淋巴結通過光學成像進行區(qū)分，從而顯著改善小鼠模型中原位乳腺癌腫瘤手術的結果（圖 1）。該方法可以克服 FGS 近紅外 II 探針的局限性，并為更有效和準確的成像引導手術干預鋪平道路。
圖1. 具有腎臟排泄特性的NIR-II BFC6TP 納米團簇，可實現(xiàn)高性能NIR-II 成像引導手術以及淋巴結（LN）、血管和腫瘤成像。
S-D-A-D-S 染料可控地自組裝成納米團簇及其體內藥代動力學
該研究合成了兩個用于 NIR-II 成像的明亮探針，分別命名為 BFC6P 和 BFC6TP，它們與兩條 1.5 kDa 的聚乙二醇 （PEG） 鏈偶聯(lián)（如圖2a，b）。BFC6P和BFC6TP在約730 nm處具有吸收峰，并具有約為1050 nm的NIR-II熒光發(fā)射（圖1）。2c， d）。當溶解在水溶液中時，S-D-A-D-S染料可以自發(fā)組裝成納米顆粒。研究發(fā)現(xiàn)，將屏蔽單元從芴改為苯會導致自組裝染料納米團簇形成的尺寸減小，導致藥代動力學從肝膽向腎臟排泄發(fā)生變化。在這項研究中，將供體單元從己基呋喃（BFC6P）替換為己基叔（乙二醇）呋喃（BFC6TP），這導致染料納米團簇的尺寸進一步減小（圖2e-j）。DLS測得的水合直徑BFC6TP和BFC6P的水合直徑分別為40.1 nm±8.6 nm和84.7 ± 24.2 nm，而100 k超濾后的粒徑分別為2.9 ± 1.4 nm和3.2 ± 0.2 nm。然而，分子的聚集行為受多種因素的影響，如濃度、溶出緩沖液和溫度，但在所有的體外測量中，BFC6TP納米團簇的尺寸始終小于BFC6P納米團簇的尺寸。這進一步證明了BFC6TP的設計有效。
圖2. S-D-A-D-S染料可控地自組裝成染料納米團簇，而供體工程提供了一種控制自組裝過程的策略，從而形成超小染料納米團簇。
體外細胞毒性和細胞成像測試證明，我們的染料具有良好的生物相容性和成像能力。然后，研究了小鼠靜脈注射BFC6TP納米團簇后BFC6TP納米團簇的體內藥代動力學。在前5分鐘內，在膀胱中檢測到強熒光信號，而在肝臟中觀察到弱熒光信號（圖2k）。與BFC6P納米團簇相比，BFC6TP納米團簇表現(xiàn)出更快的腎臟清除率和更低的肝臟蓄積（圖2 l）。在藥代動力學實驗期間，觀察到熒光信號隨時間推移而耗盡，在 24 小時時間點幾乎消失。此外，從PBS過渡到FBS時觀察到的兩種染料納米團簇的尺寸變化表明，兩種類型的納米團簇都表現(xiàn)出分解行為。然而，與BFC6TP相比，BFC6P保持了更大的尺寸，這可歸因于BFC6P內供體上的烷基鏈導致疏水性增加。這導致肝臟中的保留更大，因此肝臟和腎臟清除率減慢（圖S8）。總的來說，BFC6TP納米團簇的低器官積累提供了更好的成像對比度，快速的腎臟排泄有助于整體生物安全性，使其非常適合NIR-II成像和成像引導手術（圖2m）。
BFC6TP納米團簇可實現(xiàn)高性能的NIR-II血管造影、淋巴造影和腫瘤成像
BFC6TP納米團簇在相對較短的成像窗口內提供高性能的NIR-II血管造影。這對于需要重復影像學的生物事件或病變部位極為重要，因為相對較短的影像學窗口具有最小的背景信號和高影像學對比度。在將BFC6TP納米團簇靜脈注射到脫毛的Balb / c小鼠中后，后肢血管逐漸變得可見，在NIR-II成像期間，動脈和靜脈血管在選定的時間點均可區(qū)分，顯示出顯著的成像對比度（圖3a， b）。五個選定感興趣區(qū)域的血管與肌肉的比率均高于 2（圖 4c）。在較長的亞NIR-II窗口下成像進一步增強了成像對比度，導致大腦和后肢的血管與肌肉比增加（圖3d 和 e）。
圖3 BFC6TP納米團簇可實現(xiàn)高性能的NIR-II血管造影、淋巴造影、成像引導手術和腫瘤成像。
BFC6TP納米團簇還支持高性能的NIR-II淋巴造影和成像引導手術。腳墊注射BFC6TP納米團簇后，NIR-II淋巴造影顯示前哨淋巴結清晰（圖3f）。瘤內注射BFC6TP納米團簇后，繪制了時間依賴性LN與肌肉和腫瘤與肌肉的比率（圖3g，h）顯示前哨LN可以清晰地可視化。因此，BFC6TP納米團簇有助于通過NIR-II成像引導手術精確切除腫瘤浸潤性前哨LN。BFC6TP納米團簇還提供了位于小鼠乳房的遠端淋巴結和遠端腫瘤的成像。BFC6TP納米團簇被發(fā)現(xiàn)沿著淋巴系統(tǒng)遷移到腫瘤，因此對于癌癥手術期間的術中腫瘤可視化至關重要。在患有乳腺異種移植 4T1 腫瘤的小鼠尾部附近皮內注射 BFC6TP 納米團簇后，探針照亮了前哨淋巴結 （SLN） 和淋巴管系統(tǒng)，隨著時間的推移逐漸出現(xiàn)強烈的腫瘤信號（圖3i）。這表明隨著時間的推移，探針可以從注射部位遷移到 SLN、更高級別的淋巴結和遠端腫瘤。在尾部堿基注射后24小時內，腫瘤和SLNs保持高度分離，熒光強度相對較高（圖1）。4J）。此外，將BFC6TP納米簇靜脈注射到4T1荷瘤小鼠中可提高NIR-II腫瘤成像能力，在注射后9小時內出現(xiàn)腫瘤中的最大信號積累（圖3k）。循環(huán)24 h后，4T1腫瘤中仍有高信號（圖3l），表明BFC6TP納米團簇在內部原發(fā)腫瘤被動靶向方面的潛在應用。同時識別腫瘤和腫瘤引流 SLN 的能力對各種癌癥（包括乳腺癌和皮膚黑色素瘤）的非侵入性診斷和影像學引導手術具有重要意義。
BFC6TP納米團簇術中NIR-II成像引導手術有效抑制腫瘤轉移
為了實現(xiàn)SLNs的精確圖像引導切除并抑制腫瘤復發(fā)，在4T1荷瘤小鼠中進行~25 μL BFC6TP（350 μM）納米團簇的腫瘤內注射，以對SLNs進行成像。建立具有原位乳腺癌模型的小鼠，并將其隨機分為四組：未治療組（第 1 組，對照組）、SLN 切除組（第 2 組）、腫瘤切除組（第 3 組）和 SLN 和腫瘤均被切除的組（第 4 組）。在高分辨率NIR-II成像下，胸肱淋巴結的腫瘤鄰近SLN從周圍組織精確可見。NIR-II 成像引導手術是通過切除 SLN、腫瘤或兩者的組合進行的，然后仔細縫合傷口。在實驗期間每天監(jiān)測四組小鼠的腫瘤體積和體重。37天后，處死小鼠，并評估離體腫瘤轉移的抑制作用（圖4a）。手術切除原發(fā)腫瘤或SLNs可以通過中斷腫瘤轉移途徑顯著延長小鼠的存活時間�？傮w而言，原發(fā)腫瘤和SLN切除的第4組對腫瘤復發(fā)和轉移的抑制效果最好。
圖4. 術中NIR-II成像引導的腫瘤/腫瘤鄰近SLNs切除可有效抑制腫瘤轉移。a 描述動物實驗的設計和工作流程的方案
結論：
綜上所述，熒光引導手術（FGS）是一種很有前途的提高實體瘤患者手術準確性的技術。然而，目前FGS技術的局限性促使研究人員開發(fā)了NIR-II FGS，它受益于低自發(fā)熒光和長成像窗口下的散射。NIR-II FGS 可以在工作燈下進行，為此開發(fā)理想的 NIR-II 探針很有希望。屏蔽單元-供體-受體-供體-屏蔽單元（S-D-A-D-S）染料已被開發(fā)為一種高度穩(wěn)定的NIR-II探針，但它們的自組裝導致在主要器官中積累，導致明顯的背景信號和潛在的長期毒性。本研究優(yōu)化了S-D-A-D-S染料的供體結構，形成超小染料納米團簇，促進腎臟排泄，最小化背景信號。基于S-D-A-D-S染料納米團簇的NIR-II FGS，大大實現(xiàn)了高性能的NIR-II成像引導手術，并改善了根治性淋巴結清掃術的結果，使腫瘤鄰近的前哨淋巴結具有光學可辨別性，從而顯著改善了腫瘤手術的結果。我們證明，精確切除原發(fā)腫瘤和腫瘤浸潤性 SLN 對于預防癌癥轉移是必要的，尤其是對于深部組織的原發(fā)性癌。切除淋巴系統(tǒng)顯著減少腫瘤轉移途徑，從而減少肺部和其他器官的轉移性病變。本研究中的方法代表了一種有前途的方法，可以克服 FGS 近紅外 II 探針的局限性。
基于ICG的紅外成像程序在數(shù)十萬患者中廣泛進行，利用NIR-II窗口的優(yōu)勢可以提高其臨床結果。然而，已知ICG具有高度不穩(wěn)定性。因此，開發(fā)具有超穩(wěn)定成像能力的D-A-D染料將為該領域做出重大貢獻。了解 S-D-A-D-S 染料的固有組裝機制對于促進其臨床轉化至關重要，因為理想的探針應在成像后及時從體內排出。此外，NIR-II/PET 雙模成像探頭的未來發(fā)展將為癌癥患者帶來顯著的益處。這些探頭不僅可以為放射治療提供增強的成像引導，還可以使用手術機器人進行后續(xù)的成像引導手術。這種在單個探針中集成多種功能對于提高癌癥治療的精確度和有效性具有巨大的前景。
參考文獻
Wang, Y., Zhou, D., Ma, H. et al. An ultra-small organic dye nanocluster for enhancing NIR-II imaging-guided surgery outcomes. Eur J Nucl Med Mol Imaging (2024).
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