高分辨化學成像顯微鏡mIRage在單細胞同位素成像中的應(yīng)用

導(dǎo)讀

在傳統(tǒng)微生物代謝研究中，同位素標記法是探索細胞/細菌特定代謝進程的常用手段。由于同位素會影像生物大分子的化學震動，科研工作者可以通過紅外光譜成像對含有同位素的微生物或細胞進行紅外檢測。但是傳統(tǒng)紅外的分辨率有限，致使多數(shù)研究只能聚焦于細胞群落層面，難以深入至單個細胞�；�于新型光學光熱紅外 (O-PTIR) 化學成像技術(shù)的發(fā)展，為該領(lǐng)域帶來了重要轉(zhuǎn)機。該技術(shù)大幅提升了傳統(tǒng)紅外化學成像的空間分辨率，能夠在亞微米空間尺度下，依據(jù)化學特征，對不同物質(zhì)進行特異性化學成像。借助O-PTIR技術(shù)，科研人員不僅能對的同位素標記的微生物進行紅外波譜分析，還能對同位素的單個微生物、細胞進行化學成像，為微生物單細胞代謝研究提供更為豐富、詳盡的信息。

新一代化學成像顯微鏡

美國PSC公司研發(fā)的新一代高分辨化學成像顯微鏡——mIRage，大大地拓展了光學顯微鏡的應(yīng)用。該設(shè)備基于新型光學光熱紅外（O-PTIR）技術(shù)，能夠?qū)ξ镔|(zhì)的分子結(jié)構(gòu)進行化學成像，解決了傳統(tǒng)化學成像空間分辨率低的問題，其化學成像分辨高達500 nm，可在亞微米尺度上對單個細胞、微生物內(nèi)同位素標記物進行成像與波譜分析。同時，該系統(tǒng)還兼具拉曼波譜，可以對同一個樣品進行紅外/拉曼共定位分析，為微生物代謝組學、微生物藥物組學、藥學等多個生命科學研究領(lǐng)域提供了新的表征手段。

新一代高分辨化學成像顯微鏡——mIRage

mIRage的特有優(yōu)勢：

• 亞微米空間分辨的紅外光譜和拉曼高光譜成像（~500 nm）；
• 與透射模式相媲美的反射模式下的圖譜效果；
• 非接觸測量模式—使用簡單快捷，無交叉污染風險；
• 很少或無需樣品制備過程(無需薄片), 可測試厚樣品；
• 可透射模式下觀察溶液中的樣品；
• 實現(xiàn)同時同地相同分辨率的IR和Raman測試；
• 熒光顯微成像實現(xiàn)熒光標記樣品快速定位。

mIRage部分同位素成像應(yīng)用

一、mIRage助力單細胞水平同位素成像研究細菌代謝

英國利物浦大學Roy Goodacre教授發(fā)表了關(guān)于同位素標記的細菌振動光譜研究成果。該研究借助于新一代高分辨化學成像顯微鏡——mIRage，通過紅外光譜和成像分析，揭示了細菌代謝的過程和機理，不僅包含細菌群落，還包含微生物之間的相互作用。該成果創(chuàng)新性的運用新型光學光熱紅外 (O-PTIR) 化學成像技術(shù)，實現(xiàn)了在單細胞水平上準確評估細菌對標記化合物的吞并行為過程，為細菌代謝研究開辟了新的途徑。

二、 mIRage高分辨率表征助力細菌耐藥性研究

近期，mIRage的高空間分辨率和光譜質(zhì)量又助力一科研團隊通過氘同位素標記在單細胞水平上快速鑒定抗菌素耐藥性。在該研究中，作者采用了光學光熱紅外 (O-PTIR) 化學成像技術(shù)的非破壞性表型分析方法，結(jié)合氘同位素探測 (DIP) 和多元統(tǒng)計分析作為代謝指紋識別方法，在單細胞和群體水平上檢測尿路致病大腸桿菌中的抗生素耐藥性。

下圖為未處理和甲氧芐啶TMP處理條件下生長的兩種大腸桿菌分離株（上圖A和D為光學成像）的 O-PTIR成像。未處理（圖A）和 TMP 處理（圖D）大腸桿菌細胞（分離株 147，TMP 敏感）的光學圖像突出顯示了單個細胞的位置。在未處理（圖B）和TMP處理（圖E）條件下生長的這些細菌細胞在蛋白質(zhì)酰胺 I 帶的1,655 cm^-1峰進行紅外成像，也顯示出與背景的明顯對比。然而，在同一視野下，使用 2,163 cm^-1 處的峰值（歸因于 C-D 振動），未經(jīng)處理的TMP敏感大腸桿菌細胞（圖C）清晰可見，表明它們具有代謝活性并吸收了氘，而TMP處理的細胞幾乎未被檢測到，表明它們不具有代謝活性，因此不能吸收氘（圖F）。

通過O-PTIR 光譜數(shù)據(jù)鑒別由于氘摻入細菌細胞導(dǎo)致的明顯光譜偏移 (C-D 特征峰)，從而可以在單細胞水平上快速檢測和分類敏感和耐藥分離株，并發(fā)現(xiàn)了甲氧芐啶敏感菌株在暴露于這種抗生素時攝入氘的能力降低。本研究的結(jié)果表明mIRage是一種可在單細胞水平上快速檢測抗生素抗藥性的有效工具。

三、mIRage協(xié)助研究單細胞水平的多種同位素的光譜變化

mIRage紅外光譜協(xié)助科研工作者在單細胞水平上研究碳-氘動力學和同位素光譜偏移。在該研究中，團隊采用了多種重穩(wěn)定同位素 (D、¹³C、¹⁵N 和 ¹⁸O) 組合，使用光學光熱紅外 (O-PTIR) 化學成像技術(shù)在單細胞水平上評估中紅外區(qū)域所有可能的同位素光譜偏移。

如下圖所示，由于重同位素摻入了各種生物分子，通過mIRage可以觀察到多種同位素組會導(dǎo)致的多種振動峰的幾個光譜偏移。單個大腸桿菌細菌細胞的 O-PTIR 光譜數(shù)據(jù)在所有含有重水的條件下都顯示出兩個不同的峰（Csingle bondD 特征峰），包括D₂O（圖A）、¹³C + D₂O（圖B）、¹⁵N + D₂O（圖C）和 ¹³C + ¹⁵N + D₂O（圖D）。在同時含有 ¹³C 和 D₂O 的條件下，在 ¹³C + D₂O（圖B）以及¹³C + ¹⁵N + D₂O（圖D）條件下，對稱 CD₃（從 2,213 cm^-1 到 2,198 cm^-1）和對稱 CD2（2175 cm^-1 到 2163 cm^-1）中觀察到了額外的偏移。

這項研究的結(jié)果表明，O-PTIR 可以作為監(jiān)測單個細菌中多種同位素標記的有效工具。

總結(jié)

在上述案例中，mIRage展現(xiàn)了能夠?qū)�單個微生物內(nèi)同位素標記物質(zhì)進行高分辨化學成像的能力。這意味著它不僅可以準確捕獲單個細胞、微生物內(nèi)同位素標記的圖像，也可以對單個細胞的同位素藥物攝入過程進行表征。尤其值得注意的是，面對同一細胞內(nèi)多種同位素并存的復(fù)雜情況，mIRage也能實現(xiàn)特異性表征，準確地反饋特定物質(zhì)在細胞內(nèi)的分布與化學變化。

憑借上述超卓的性能，mIRage在微生物代謝組學、微生物藥物代謝、藥學等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力，能夠為科研工作者提供不一樣的研究視角和準確的數(shù)據(jù)。

除了上述應(yīng)用外，mIRage這一熒光、紅外、拉曼三合一的化學成像顯微還在多個科研領(lǐng)域有所應(yīng)用：

1.  環(huán)境微塑料

微塑料顆粒（~600 nm）的O-PTIR光譜及成像分析
(引自Microscopy Today, 2022, 17, 3, 76-85)

2. 高分子材料

1210 cm^-1處采集的PP/PTFE的O-PTIR光譜和顯微圖像
(引自Materials & Design, 211 (2021), 17, 110157)

3. 半導(dǎo)體

薄膜晶體管顯示器中污染物的O-PTIR分析

器件表面缺陷的紅外和拉曼光譜同步（同時間、同位置）分析
(引自Microscopy Today, 2020, 28, 3, 26-36)

4. 生命科學

腦組織的明場顯微圖像、O-PTIR光譜及成像分析

5. 文物鑒定

柯羅19世紀繪畫作品中鋅皂異質(zhì)性的O-PTIR顯微光譜及成像分析
(引自Anal. Chem. 2022, 94, 7, 3103–3110)

mIRage國內(nèi)部分發(fā)表文章一覽

☛ 中國農(nóng)業(yè)大學借助mIRage成功實現(xiàn)對玉米粉中痕量微塑料的原位可視化表征。該工作發(fā)表在Science of the Total Environment上。

☛ 中科院過程工程研究所使用mIRage對利拉魯肽微球的藥物與載藥顆粒的化學成分與空間分布進行了鑒定，該成果發(fā)表在ACS Applied Materials & Interfaces上。

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