文獻解讀：超聲波破解鎮(zhèn)痛密碼探究阿片類止痛藥如何“改造”大腦
功能性超聲（functional ultrasound, fUS）技術是一種新型的腦功能成像技術，其最關鍵的革新在于能夠方便地實現(xiàn)清醒活動動物的腦功能成像，突破了傳統(tǒng)技術的局限，為各種行為范式下的全腦功能檢測提供了新的可能性。此外，該技術具有更高的信噪比與時空分辨率，這些優(yōu)點使得基于fUS的藥理學檢測成為一種強大的研究手段。
我們往期的公眾號已經介紹了fUS藥理學的很多相關內容：
◾ fUS腦功能成像技術在藥物研究中的應用（點擊鏈接，查看內容）
◾ 在清醒動物上用fUS技術開展藥理學實驗（點擊鏈接，查看內容）
這次我們繼續(xù)介紹一篇采用fUS技術來研究神經藥理的文章，文章標題是“Opioid-Induced Inter-regional Dysconnectivity Correlates with Analgesia in Awake Mouse Brains”，來自法國國家健康與醫(yī)學研究院（INSERM）的Zsolt Lenkei教授和Andrea Kliewer教授團隊。
在這篇文章中作者提出的“功能連接指紋”這一概念，從這個角度可以更好地解讀fUS所提供的龐雜信息，相信能夠給未來藥理學的全腦功能研究提供新的啟迪。
研究背景
由于對藥物如何影響大腦功能的理解不足，難以開發(fā)高效且低副作用的鎮(zhèn)痛藥和抗精神病藥。傳統(tǒng)功能磁共振成像（functional magnetic resonance imaging, fMRI）雖能通過血氧信號間接反映腦活動與功能連接（functional connectivity, FC），但需麻醉動物，而麻醉劑（如美托咪定）會干擾皮質-丘腦連接，影響鎮(zhèn)痛研究。
為此，研究者引入fUS技術，其具備亞秒級時間分辨率和100微米空間分辨率，可在清醒小鼠中無創(chuàng)監(jiān)測腦血流（cerebral blood volume, CBV）和FC。研究以μ-阿片受體（mu-opioid receptor, MOP）激動劑（嗎啡、芬太尼等）為模型，通過單冠狀腦片高靈敏度成像，發(fā)現(xiàn)阿片類藥物能夠顯著引發(fā)新皮層-海馬-丘腦網(wǎng)絡功能連接重組（劑量與時間依賴性），且這種“功能連接指紋”與鎮(zhèn)痛效果及MOP激活同步，但與呼吸抑制等副作用無關。慢性用藥后，功能連接變化與鎮(zhèn)痛耐受一致。研究結合行為學（運動、鎮(zhèn)痛）和分子指標（MOP磷酸化），驗證了功能連接作為藥效標志物的可靠性，為開發(fā)精準神經精神藥物提供了新策略。
研究結果
清醒小鼠中嗎啡的藥理fUS特征
為了研究阿片類藥物對大腦功能的影響，作者利用fUS在清醒未處理顱骨小鼠上進行腦功能成像，這一工作在ICONEUS fUS成像系統(tǒng)和氣浮籠上完成，后者為頭部固定的小鼠提供易于適應的活動空間和穩(wěn)定的成像效果，最大程度地保證清醒小鼠fUS的實驗效果。
在給藥前，記錄20分鐘作為基線，注射藥物后記錄60分鐘觀察藥物作用，基線和給藥后的時間都以10分鐘來劃分區(qū)段，BP1-2為兩個給藥前時間段，SP1-6是給藥后的6個時間段。對記錄到的信號進行經典的功能連接分析，這一方法在fMRI中被廣泛采用，檢測的是腦區(qū)之間自發(fā)波動的相關性強弱，這一指標和大腦的功能狀態(tài)密切相關，在藥理學研究中，給藥前后的功能連接變化可以反應藥物對大腦功能狀態(tài)的改變。
圖1. 清醒動物中的藥理fUS方法和嗎啡的檢測結果。(I) ROI功能連接相關性/顯著性矩陣。方框標注四個元區(qū)域（皮層、海馬、丘腦和下丘腦）。左下三角顯示（藍色-紅色）給藥后平均相關性矩陣，右上三角展示（綠色-紫色）顯著性差異的ROI對的功能連接改變量。(J) 顯著性相關圖展示矩陣中顯著變化部分：節(jié)點編碼各ROI的全局連接性，綠色-紫色邊表示相關性顯著變化的邊。
圖1. 清醒動物中的藥理fUS方法和嗎啡的檢測結果。(K) 幾個特征性腦區(qū)的seedmap分析圖。上行（藍色-紅色）代表給藥后各腦區(qū)平均的seedmap功能連接，下行（綠色-紫色）代表seedmap上有顯著性差異的位置的功能連接變化量。
功能連接的分析通常有兩種不同的方式，一種為matrix分析（圖1. I J），一種為seed map分析（圖1. K），前者反應成像范圍中所有目標腦區(qū)兩兩間的相關性，后者反應一個特定腦區(qū)與圖像中其它部分之間的相關性強弱。
接下來，作者首先對代表性的阿片類止痛藥物嗎啡做了藥理fUS檢測。在圖1中我們可以清楚地看到，在注射后40分鐘，皮層-皮層區(qū)域和海馬-丘腦之間的功能連接增強，而皮層與皮下結構之間的功能連接則減少（圖1. I J K）。
這些結果表明，在清醒小鼠大腦中，嗎啡顯著重塑了區(qū)域內和區(qū)域間的功能連接模式，其主要特征為皮層與皮下結構之間出現(xiàn)負相關。
多種阿片類藥物的功能連接指紋特征
在這里作者提到了一個重要的概念：功能連接指紋特征（FC fingerprints），有助于我們更好地理解藥理fUS的結果。從嗎啡的檢測結果可以看到，fUS提供的是大范圍多腦區(qū)的功能連接檢測結果，其中包含的信息量巨大，我應該如何解讀這樣的結果？在這里，作者將藥物引起的大量腦區(qū)的功能連接改變作為一個整體來考察，不同藥物的作用可以看作一個獨特的功能連接指紋，不同指紋在模式上的異同可以反應藥物效應的差異性和近似性。
因此，作者檢測了多種不同的阿片類藥物，包括芬太尼、甲苯咪唑和丁丙諾啡，得到了不同藥物的功能連接指紋。
這些結果顯示，主要的阿片類藥物會引發(fā)一種高度一致的功能失連模式，作者稱之為“阿片指紋”（opioid fingerprint），藥物耐受的實驗更強有力地支持了阿片類藥物誘導的、MOP特異性的功能連接指紋在功能上的重要性，也進一步突顯其在響應不同MOP作用配體中的意義。
功能連接指紋與腦血容量、行為和MOP激活水平的相關性
除了前文提到用fUS來檢測給藥前后功能連接的改變，藥理學fUS另一個常用的方式是直接檢測藥物引起的各腦區(qū)灌注（CBV）的改變。清醒小鼠上的檢測發(fā)現(xiàn)，注射嗎啡或芬太尼（但非生理鹽水）后的CBV變化表現(xiàn)為典型的先期區(qū)域性高灌注，隨后是較長時間的低灌注，其振幅和動態(tài)與劑量和MOP激動劑效能密切相關（圖5. A）。
為驗證這些觀察結果，作者對70 mg/kg 嗎啡實驗中除呼吸抑制外的所有生理指標進行了PCA分析（圖6C-E）。結果顯示，僅兩個主成分即可解釋大部分變量變化：第一個主成分（PC1）與FC指數(shù)、鎮(zhèn)痛和MOP磷酸化高度相關；第二個主成分（PC2）與運動和CBV最相關（圖5D）。這些實驗結果表明：阿片類藥物引起的FC變化具有重要藥理學意義，因為它們是MOP特異性的，體現(xiàn)了時間依賴性、劑量依賴性以及耐受性的發(fā)展。更重要的是，與局部灌注變化不同，FC的改變與鎮(zhèn)痛效應這一臨床重要行為輸出高度相關，而與呼吸抑制這一嚴重副作用無明顯相關。
總結
這篇工作給我們提供了一個非常好的實例，如何利用fUS來進行神經藥理學的研究：
1. fUS非常適合在清醒活動的動物上進行大范圍的腦功能檢測，并且具有極佳的敏感性和時空分辨率，并且可以透過顱骨成像，非侵入性地進行成像，是小動物藥理學研究中一個非常重要的新工具。
2. 功能連接指紋：由于fUS能供提供大量腦區(qū)的巨量信息，因此我們可以從“功能指紋”的角度理解這些信息。在這篇文章中，作者發(fā)現(xiàn)多種阿片類藥物引起的功能連接改變具有高度的一致性，這種共有的變化模式被作者稱為“阿片指紋”，進一步的研究表明這種阿片指紋由MOP介導，并與鎮(zhèn)痛效果高度相關。因此這種“指紋”可以作為一種關鍵性的biomarker，用于鎮(zhèn)痛藥物的開發(fā)與評估。
3. 藥理學fUS可以提供兩種不同的檢測方式：
a) 功能連接，即檢測給藥前后不同時間段的多腦區(qū)功能連接改變
b) 局部腦灌注，即給藥前后各腦區(qū)CBV的改變
在這篇工作中，通過與分子學，行為學的相關檢測數(shù)據(jù)的相關性分析發(fā)現(xiàn)，FC改變與鎮(zhèn)痛效果高度相關，而與活動的增多無關；而CBV的快速改變則與給藥后動物活動的增加有高相關性，但也有部分CBV的改變并非由動物的活動增加引起，提示可能與神經活動的增加有關。
參考文獻
英文原文鏈接：https://doi.org/10.1101/2024.07.30.604249
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禮智生物科技是ICONEUS在中國的獨家授權經銷商，積累了豐富的fUS及ULM技術的手術、實驗和數(shù)據(jù)分析經驗，歡迎廣大師生攜動物來禮智神經影像中心體驗fUS技術�。�(lián)系方式見文末）
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禮智生物科技有限公司成立于2011年，是神經科學領域專業(yè)的科研儀器及技術服務供應商，在香港、上海、北京、廣州、南京、沈陽等地均設有分公司。
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研究背景
由于對藥物如何影響大腦功能的理解不足，難以開發(fā)高效且低副作用的鎮(zhèn)痛藥和抗精神病藥。傳統(tǒng)功能磁共振成像（functional magnetic resonance imaging, fMRI）雖能通過血氧信號間接反映腦活動與功能連接（functional connectivity, FC），但需麻醉動物，而麻醉劑（如美托咪定）會干擾皮質-丘腦連接，影響鎮(zhèn)痛研究。
為此，研究者引入fUS技術，其具備亞秒級時間分辨率和100微米空間分辨率，可在清醒小鼠中無創(chuàng)監(jiān)測腦血流（cerebral blood volume, CBV）和FC。研究以μ-阿片受體（mu-opioid receptor, MOP）激動劑（嗎啡、芬太尼等）為模型，通過單冠狀腦片高靈敏度成像，發(fā)現(xiàn)阿片類藥物能夠顯著引發(fā)新皮層-海馬-丘腦網(wǎng)絡功能連接重組（劑量與時間依賴性），且這種“功能連接指紋”與鎮(zhèn)痛效果及MOP激活同步，但與呼吸抑制等副作用無關。慢性用藥后，功能連接變化與鎮(zhèn)痛耐受一致。研究結合行為學（運動、鎮(zhèn)痛）和分子指標（MOP磷酸化），驗證了功能連接作為藥效標志物的可靠性，為開發(fā)精準神經精神藥物提供了新策略。
研究結果
清醒小鼠中嗎啡的藥理fUS特征
為了研究阿片類藥物對大腦功能的影響，作者利用fUS在清醒未處理顱骨小鼠上進行腦功能成像，這一工作在ICONEUS fUS成像系統(tǒng)和氣浮籠上完成，后者為頭部固定的小鼠提供易于適應的活動空間和穩(wěn)定的成像效果，最大程度地保證清醒小鼠fUS的實驗效果。
在給藥前，記錄20分鐘作為基線，注射藥物后記錄60分鐘觀察藥物作用，基線和給藥后的時間都以10分鐘來劃分區(qū)段，BP1-2為兩個給藥前時間段，SP1-6是給藥后的6個時間段。對記錄到的信號進行經典的功能連接分析，這一方法在fMRI中被廣泛采用，檢測的是腦區(qū)之間自發(fā)波動的相關性強弱，這一指標和大腦的功能狀態(tài)密切相關，在藥理學研究中，給藥前后的功能連接變化可以反應藥物對大腦功能狀態(tài)的改變。
圖1. 清醒動物中的藥理fUS方法和嗎啡的檢測結果。(A-C)
圖1. 清醒動物中的藥理fUS方法和嗎啡的檢測結果。(D-H)
功能連接的分析通常有兩種不同的方式，一種為matrix分析（圖1. I J），一種為seed map分析（圖1. K），前者反應成像范圍中所有目標腦區(qū)兩兩間的相關性，后者反應一個特定腦區(qū)與圖像中其它部分之間的相關性強弱。
接下來，作者首先對代表性的阿片類止痛藥物嗎啡做了藥理fUS檢測。在圖1中我們可以清楚地看到，在注射后40分鐘，皮層-皮層區(qū)域和海馬-丘腦之間的功能連接增強，而皮層與皮下結構之間的功能連接則減少（圖1. I J K）。
圖2. 嗎啡功能連接（FC）特征的劑量與時間依賴性。
隨后，作者進一步檢測了不同劑量和不同時間點嗎啡引起的功能連接改變。圖2中我們可以看到，注射生理鹽水對各時間點（給藥前BP1-2，給藥后SP1-6）的功能連接沒有影響。相比之下，隨著嗎啡劑量的增加，功能連接變化出現(xiàn)得更早，可能反映出更早達到MOP占據(jù)的關鍵水平，而較高劑量導致更強的FC變化。這些結果表明，在清醒小鼠大腦中，嗎啡顯著重塑了區(qū)域內和區(qū)域間的功能連接模式，其主要特征為皮層與皮下結構之間出現(xiàn)負相關。
多種阿片類藥物的功能連接指紋特征
在這里作者提到了一個重要的概念：功能連接指紋特征（FC fingerprints），有助于我們更好地理解藥理fUS的結果。從嗎啡的檢測結果可以看到，fUS提供的是大范圍多腦區(qū)的功能連接檢測結果，其中包含的信息量巨大，我應該如何解讀這樣的結果？在這里，作者將藥物引起的大量腦區(qū)的功能連接改變作為一個整體來考察，不同藥物的作用可以看作一個獨特的功能連接指紋，不同指紋在模式上的異同可以反應藥物效應的差異性和近似性。
因此，作者檢測了多種不同的阿片類藥物，包括芬太尼、甲苯咪唑和丁丙諾啡，得到了不同藥物的功能連接指紋。
圖3. 不同阿片類藥物對功能連接影響的特征
圖3結果顯示，類似于嗎啡，芬太尼劑量升高引發(fā)的功能連接變化更早更顯著，呈現(xiàn)出與嗎啡相似的腦區(qū)間功能失連模式。甲苯咪唑（完全激動劑）也表現(xiàn)出類似模式，而丁丙諾啡（部分激動劑）雖有類似模式但強度較弱，這一結果整體表明功能連接模式的變化強度與MOP激動劑的效能密切相關。 圖4. 阿片類受體耐受情況中的功能連接指紋特征
阿片類藥物的行為效應（如鎮(zhèn)痛、欣快和鎮(zhèn)靜）在重復給藥后會產生耐受性。因此，患者或藥物使用者需要更高劑量才能獲得相同效果，這也帶來了呼吸抑制、便秘、成癮和過量等副作用風險的增加。作者希望研究嗎啡和芬太尼誘導的FC變化是否也表現(xiàn)出耐受性特征。為此，作者使用植入的滲透泵對小鼠進行為期一周的慢性嗎啡或芬太尼給藥處理，結果顯示鎮(zhèn)痛效應已顯著減弱。值得注意的是，該方案在單次注射后所引起的功能連接顯著變化也減少了，表明與未慢性處理動物相比，其響應減弱（圖4）。這些結果顯示，主要的阿片類藥物會引發(fā)一種高度一致的功能失連模式，作者稱之為“阿片指紋”（opioid fingerprint），藥物耐受的實驗更強有力地支持了阿片類藥物誘導的、MOP特異性的功能連接指紋在功能上的重要性，也進一步突顯其在響應不同MOP作用配體中的意義。
功能連接指紋與腦血容量、行為和MOP激活水平的相關性
除了前文提到用fUS來檢測給藥前后功能連接的改變，藥理學fUS另一個常用的方式是直接檢測藥物引起的各腦區(qū)灌注（CBV）的改變。清醒小鼠上的檢測發(fā)現(xiàn)，注射嗎啡或芬太尼（但非生理鹽水）后的CBV變化表現(xiàn)為典型的先期區(qū)域性高灌注，隨后是較長時間的低灌注，其振幅和動態(tài)與劑量和MOP激動劑效能密切相關（圖5. A）。
圖5. 嗎啡誘導的功能連接（FC）變化與灌注、MOP激活和行為的相關性。
接下來，作者希望進一步理解之前發(fā)現(xiàn)的MOP特異性FC變化與腦灌注改變及阿片類藥物誘導的行為之間的關系。分析結果顯示，各腦區(qū)CBV的改變與動物注射阿片類藥物短時間內活動的增加相關，但也并非完全由活動增加引起，而藥物引起的呼吸抑制（阿片類藥物重要的臨床副作用）也與CBV變化在時間上相關。值得強調的是，這些血管和行為事件在時間上與FC變化的相關性較低，雖然運動、呼吸和CBV的變化快速且同步，但嗎啡誘導的功能連接重組相對較慢（圖5. A B）。為驗證這些觀察結果，作者對70 mg/kg 嗎啡實驗中除呼吸抑制外的所有生理指標進行了PCA分析（圖6C-E）。結果顯示，僅兩個主成分即可解釋大部分變量變化：第一個主成分（PC1）與FC指數(shù)、鎮(zhèn)痛和MOP磷酸化高度相關；第二個主成分（PC2）與運動和CBV最相關（圖5D）。這些實驗結果表明：阿片類藥物引起的FC變化具有重要藥理學意義，因為它們是MOP特異性的，體現(xiàn)了時間依賴性、劑量依賴性以及耐受性的發(fā)展。更重要的是，與局部灌注變化不同，FC的改變與鎮(zhèn)痛效應這一臨床重要行為輸出高度相關，而與呼吸抑制這一嚴重副作用無明顯相關。
總結
這篇工作給我們提供了一個非常好的實例，如何利用fUS來進行神經藥理學的研究：
1. fUS非常適合在清醒活動的動物上進行大范圍的腦功能檢測，并且具有極佳的敏感性和時空分辨率，并且可以透過顱骨成像，非侵入性地進行成像，是小動物藥理學研究中一個非常重要的新工具。
2. 功能連接指紋：由于fUS能供提供大量腦區(qū)的巨量信息，因此我們可以從“功能指紋”的角度理解這些信息。在這篇文章中，作者發(fā)現(xiàn)多種阿片類藥物引起的功能連接改變具有高度的一致性，這種共有的變化模式被作者稱為“阿片指紋”，進一步的研究表明這種阿片指紋由MOP介導，并與鎮(zhèn)痛效果高度相關。因此這種“指紋”可以作為一種關鍵性的biomarker，用于鎮(zhèn)痛藥物的開發(fā)與評估。
3. 藥理學fUS可以提供兩種不同的檢測方式：
a) 功能連接，即檢測給藥前后不同時間段的多腦區(qū)功能連接改變
b) 局部腦灌注，即給藥前后各腦區(qū)CBV的改變
在這篇工作中，通過與分子學，行為學的相關檢測數(shù)據(jù)的相關性分析發(fā)現(xiàn)，FC改變與鎮(zhèn)痛效果高度相關，而與活動的增多無關；而CBV的快速改變則與給藥后動物活動的增加有高相關性，但也有部分CBV的改變并非由動物的活動增加引起，提示可能與神經活動的增加有關。
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