細胞技術(shù)專題：小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)原代培養(yǎng)實驗
小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)原代培養(yǎng)可以：（1）用于細胞保種；（2）用于分子生物學(xué)研究；（3）用于基因治療相關(guān)研究。
實驗方法
- 胰酶消化法1
- 胰酶消化法2
| 實驗方法原理 |
將小鼠的胚胎成纖維細胞（MEF）從機體中取出，經(jīng)胰酶、螯合劑（常用EDTA）處理，分散成單細胞，置MEF生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖。 |
|---|---|
| 實驗材料 |
孕鼠 |
| 試劑、試劑盒 |
PBS EDTA 胰酶 MEF生長培養(yǎng)基 FBS 高糖DMEM |
| 儀器、耗材 |
眼科直剪 眼科直鑷 眼科彎鑷 玻璃平皿3 尼龍濾網(wǎng) 離心管 手術(shù)刀片 |
| 實驗步驟 |
一、實驗材料準(zhǔn)備
1. 動物
孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。
2. 試劑
無Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.05%胰酶、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生長培養(yǎng)基(高糖DMEM加10%FBS)。
3. 器械
眼科直剪3把、眼科直鑷3把、眼科彎鑷2把、玻璃平皿3套、200目尼龍濾網(wǎng)、50 ml和15 ml離心管和手術(shù)刀片。以上物品均需要高壓滅菌消毒處理。
二、具體操作 1. 處死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超凈臺中用剪刀和鑷子將孕鼠皮膚剪開，用另外一組剪刀、鑷子剪開腹部肌層，露出子宮，最后用第三組剪刀和鑷子將子宮小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。 2. 用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內(nèi)臟，將其余胚胎轉(zhuǎn)移到一個裝有30 ml D-PBS的50 ml離心管中，輕輕顛倒兩次，倒掉D-PBS，再重復(fù)此步驟一次，注意要留少許D-PBS，然后將胚胎轉(zhuǎn)移到另一裝有D-PBS的平皿中，并用手術(shù)刀片將其細細切碎。
3. 用200 μl的移液槍反復(fù)、快速地吹打平皿中的液體，轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，于4℃ 1500 rpm離心5分鐘，倒掉上清，以10 ml胰酶重懸沉淀，放在37℃水浴中消化30分鐘，且每隔五分鐘輕輕晃動，使之充分消化。
4. 將上層細胞懸液倒入一個裝有10 ml MEF生長培養(yǎng)基的50 ml離心管中，用200目的尼龍網(wǎng)過濾后，以1 500 rpm離心5分鐘收集細胞，再用30 ml MEF生長培養(yǎng)基洗滌兩次。
5. 細胞沉淀用15 ml MEF生長培養(yǎng)基重懸后進行細胞計數(shù)(一般8只14天的胎鼠可獲得2-3×107細胞)。
6. 3×106細胞懸浮于15 ml MEF生長培養(yǎng)基中，接種到200 ml培養(yǎng)瓶中。
7. 24小時后更換新鮮的MEF生長培養(yǎng)基。
8. 細胞長滿后，先用D-PBS沖洗，倒掉后加胰酶消化(此步時間不宜過長，作者一般不超過五分鐘)，按1:5傳代。
9. 細胞再次長到覆蓋率80-90%左右，將其消化后，常規(guī)凍存(凍存液要現(xiàn)配)。
  小鼠胚胎成纖維細胞(MEF 100倍) |
| 注意事項 |
1. 原代培養(yǎng)，一定要避免污染。
2. MEF生存能力有限，如果不凍存，體外存活十代左右。
3. 凍存后復(fù)蘇的細胞只能傳代一次，因為這些細胞繁殖能力有限。
4. 消化細胞時間不要過長。 |
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