如何科學(xué)正確地建立實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)

研究人員在進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)，哪些原因會(huì)導(dǎo)致科研數(shù)據(jù)的波動(dòng)與差錯(cuò)？

1. 細(xì)胞微生物污染（如：支原體，細(xì)菌，真菌，病毒等）
2. 細(xì)胞交叉污染
3. 細(xì)胞基因突變
4. 細(xì)胞衰老
5. 人為操作失誤
 

平時(shí)，研究人員細(xì)胞的來(lái)源有三種，一種是直接從商業(yè)化公司（如ATCC、DSMZ、中科院細(xì)胞所）購(gòu)買(mǎi)，另一種為自己從原代組織分離，還有一種是從其他實(shí)驗(yàn)室或科研人員處獲取。

既然如此方便，我們?yōu)槭裁匆�自己建立�?xì)胞庫(kù)呢？有何意義？
細(xì)胞庫(kù)可以有效保持貯存細(xì)胞的生物學(xué)效用和功能，為科研實(shí)驗(yàn)提供檢定合格、質(zhì)量穩(wěn)定、可持續(xù)獲得的細(xì)胞。

1. 節(jié)省實(shí)驗(yàn)室空間、時(shí)間、經(jīng)費(fèi)
2. 若實(shí)驗(yàn)失敗，還有重來(lái)的機(jī)會(huì)
3. 確保實(shí)驗(yàn)重復(fù)的一致性
4. 確保未來(lái)實(shí)驗(yàn)的連貫性
因此實(shí)驗(yàn)室有必要建立一個(gè)安全、規(guī)范、穩(wěn)定、可追溯的細(xì)胞庫(kù)，我們需要從源頭保證整個(gè)研究實(shí)驗(yàn)的規(guī)范性。

目前，世界上較權(quán)威的細(xì)胞庫(kù)機(jī)構(gòu)或者研究院都采用三級(jí)細(xì)胞庫(kù)管理模式，即：原始細(xì)胞庫(kù)（PCB，Primary Cell Bank），主細(xì)胞庫(kù)（MCB，Master Cell Bank），工作細(xì)胞庫(kù)（WCB，Working Cell Bank）。

1. 原始細(xì)胞庫(kù)（PCB，Primary Cell Bank）

原始細(xì)胞庫(kù)（PCB，Primary Cell Bank），又名細(xì)胞種子（Cell Seed）或初級(jí)細(xì)胞庫(kù)（Pre-master Cell Bank），由一個(gè)原始細(xì)胞群體發(fā)展成為傳代穩(wěn)定的細(xì)胞群體，或者經(jīng)過(guò)克隆培養(yǎng)形成的均一細(xì)胞群體，經(jīng)檢定證明合格。將一定數(shù)量、成分均一的細(xì)胞懸液定量裝于細(xì)胞凍存管，與液氮或-130℃以下凍存，即為原始細(xì)胞庫(kù)，供建立主細(xì)胞庫(kù)使用。

2. 主細(xì)胞庫(kù)（MCB，Master Cell Bank）

主細(xì)胞庫(kù)（MCB，Master Cell Bank）指的是，原始細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞傳代增殖后均勻混合成一批，定量分裝，保存于液氮或-130℃以下。這些細(xì)胞經(jīng)檢定合格后，即為主細(xì)胞庫(kù)，供建立工作細(xì)胞庫(kù)使用。

3. 工作細(xì)胞庫(kù)（WCB，Working Cell Bank）

工作細(xì)胞庫(kù)（WCB，Working Cell Bank）是經(jīng)過(guò)主細(xì)胞庫(kù)傳代增殖，達(dá)到一定代次水平的細(xì)胞，混合后制成一批均質(zhì)細(xì)胞懸液，定量分裝于一定數(shù)量的細(xì)胞凍存管，保存于液氮或-130℃以下備用。這些細(xì)胞經(jīng)檢定證明合格后，即為工作細(xì)胞庫(kù)。

不同的細(xì)胞系傳代能力不同，因此，研究人員須根據(jù)自己的細(xì)胞系確定工作細(xì)胞的傳代次數(shù)。

▲ 細(xì)胞庫(kù)建立流程圖
 

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細(xì)胞庫(kù)的檢定

上面我們介紹過(guò)在進(jìn)行各級(jí)細(xì)胞庫(kù)的建立時(shí)，都要進(jìn)行檢定，合格后才可成為相應(yīng)細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞檢定主要包括以下幾個(gè)方面：細(xì)胞鑒別，細(xì)菌、真菌檢查，支原體檢查，細(xì)胞內(nèi)外源病毒因子檢查，致瘤性檢查，必要時(shí)還須進(jìn)行細(xì)胞染色體、細(xì)胞生長(zhǎng)特性、細(xì)胞均一度及穩(wěn)定性檢查。

▽ 細(xì)胞檢定項(xiàng)目

在建立這些細(xì)胞庫(kù)的過(guò)程，凍存這個(gè)操作步驟是非常重要的，必須要遵守“慢凍”原理，具體操作步驟可以點(diǎn)擊此處查看“細(xì)胞凍存的那些事兒”。
 

當(dāng)建立好各級(jí)細(xì)胞庫(kù)后，重要的是要如何進(jìn)行管理？
細(xì)胞庫(kù)的管理

研究人員應(yīng)檢測(cè)并維護(hù)細(xì)胞庫(kù)凍存器，以保證細(xì)胞庫(kù)貯存在一個(gè)高度穩(wěn)定的環(huán)境中。每種細(xì)胞庫(kù)均應(yīng)分別建立臺(tái)賬，詳細(xì)記錄放置位置 ，容器編號(hào)，分裝及凍存數(shù)量，取用記錄等。細(xì)胞庫(kù)中的每支細(xì)胞凍存管均應(yīng)具有細(xì)胞系/株名、代次、編號(hào)、凍存日期、貯存容器編號(hào)等信息。

▽  細(xì)胞系記錄表

 

為保證細(xì)胞凍存后仍具有良好的活力，每建立一級(jí)細(xì)胞庫(kù)，凍存前的細(xì)胞活力應(yīng)不低于90%，凍存后應(yīng)取一定量的（可代表凍存全過(guò)程）凍存管，復(fù)蘇細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，復(fù)蘇后細(xì)胞的活力應(yīng)不低于80%。一般細(xì)胞凍存2-3天溫度趨于穩(wěn)定后，即可進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)。

▽ 細(xì)胞復(fù)蘇記錄表

 

那么我們?cè)诮�立�?xì)胞庫(kù)的時(shí)候，應(yīng)該如何確定凍存數(shù)量和凍存密度呢？

原始細(xì)胞庫(kù)、主細(xì)胞庫(kù)和工作細(xì)胞庫(kù)凍存多少數(shù)量，可根據(jù)自己的需要確定，只要滿(mǎn)足后續(xù)科研實(shí)驗(yàn)需求即可，即遵循“夠用原則”。一般經(jīng)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，凍存的細(xì)胞密度為1-10×10⁶ cells/ml，凍存體積1-1.5 ml/管。
 

一些細(xì)胞冷凍保存細(xì)胞密度   ：

1. Normal human fibroblast（人成纖維細(xì)胞）：1-3×10⁶ cells/ml。
2. Hybridoma（雜交瘤細(xì)胞）：1-3×10⁶ cells/ml。
3. Adherent tumor lines（貼壁腫瘤細(xì)胞系）：5-7×10⁶ cells/ml，依細(xì)胞種類(lèi)而異。Adenocarcinoma（腺癌細(xì)胞）解凍后須較高之密度，而HeLa只需要1-3×10⁶ cells/ml。
4. Other suspensions（懸浮細(xì)胞）：5-10×10⁶ cells/ml。
5. Human lymphocyte（人淋巴細(xì)胞）：至少5×10⁶ cells/ml。
 

 參考資料

1. 國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015

細(xì)胞庫(kù)的建立方法介紹就到這里啦
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