優(yōu)化Benzonase®核酸內切酶在病毒產品純化中的應用
生物制藥生產中去除DNA的明智選擇——優(yōu)化Benzonase®核酸內切酶在病毒產品純化中的使用
Benzonase®核酸內切酶——生物制藥生產中去除DNA的明智選擇，其價值已在過去的30多年里予以了證明。使用Benzonase®核酸內切酶的生產遵循GMP (ICH Q7)，從而提供了高質可靠的產品，以此平衡工藝的高效性和法規(guī)的要求。所有Benzonase®核酸內切酶產品具有相同的核酸序列（經LC-MS/MS質譜分析證實）、穩(wěn)健性和活性。
作為一種沒有堿基偏好性的核酸內切酶，它們可以將DNA和RNA降解為3到5個堿基對(<6 kDa)的小片段，是監(jiān)管機構要求的病毒載體和疫苗生產中去除核酸的理想工具。使用Benzonase®核酸內切酶可進一步增加病毒純化的收率，保護下游層析和過濾裝置不受污染，并且降低料液粘度。
為什么要優(yōu)化Benzonase®核酸內切酶在生產工藝中的使用？
Benzonase®核酸內切酶是一款高質量產品，可為工藝帶來巨大價值。關鍵在于要以較經濟的方式使用它。由于Benzonase®核酸內切酶活性在很大程度上受到其所應用基質環(huán)境的影響，故其應用優(yōu)化應當是工藝開發(fā)中必不可少的關鍵步驟。
在本方案中，我們將提供如何規(guī)劃和建立Benzonase®核酸內切酶實驗設計（DoE）優(yōu)化實驗的指引。請注意，雖然在本方案中并未涉及Benzonase®核酸內切酶使用點（如在生物反應器中、細胞裂解后或澄清后操作）的優(yōu)化，但就整體優(yōu)化而言，則也應予以考慮。
優(yōu)化流程
1、DoE介紹
實驗設計(DoE)是指利用統(tǒng)計學規(guī)劃、實施和分析多個因子對一個或一組參數的影響。DoE是一種強大的工具，可用于各種實驗情況，如優(yōu)化酶的反應條件。為Benzonase®核酸內切酶的應用建立DoE，有助于找到最佳操作條件，達到工藝中所需的DNA清除率。
2、DoE設計
為了建立符合DoE概念的實驗系列，建議首先定義常數因子、具有中心點起始條件的輸入變量和輸出參數。
① 定義常數因子
✦需已知樣品材料的平均DNA載量，用于計算所需酶量；
✦由于病毒生產上游工藝的材料成分復雜，應用也各不相同，但Benzonase®核酸內切酶的優(yōu)化目標是一致的。因此，可將其視為常數因子，以及由培養(yǎng)環(huán)境產生的pH值和鹽濃度也可視為常數因子。有關不同化學品對Benzonase®核酸內切酶性能的影響概述，請參考我們的產品手冊；
✦由于Mg2+濃度是Benzonase®核酸內切酶發(fā)揮作用的最關鍵參數，因此應始終保持2mM的常量；
✦培養(yǎng)容器和混合工藝過程應始終保持不變。
② 定義輸入變量
平衡Benzonase®核酸內切酶的作用效果取決于：
✦Benzonase®濃度
✦孵育時間
✦孵育溫度
③ 定義輸出
由于Benzonase®核酸內切酶應用的目標是DNA消化，因此關鍵輸出為：
✦DNA含量>100 bp片段
✦產品完整性
3、已定義變量的中心點起始條件
建議設置以下起始點：
✦孵育時間設置為2個小時
✦孵育溫度設置為室溫，如21°C
Benzonase®核酸內切酶在標準測定條件下的理論濃度，根據下列公式，基于各樣品材料的DNA含量得出：
Benzonase®核酸內切酶用量應當基于隨產品提供的COA給定的實際活性（單位為U/µL）而定。
4、DoE實驗方案
下表建議Benzonase®核酸內切酶優(yōu)化實驗設置的第一種方法。這種方法選擇三種溫度條件，分別為37°C、室溫和4°C，同時選擇1、2、6個小時的三種典型培養(yǎng)時間。結合三種Benzonase®核酸內切酶濃度，是理論濃度的x倍。
▲表一：建議實驗設計
5、檢測Benzonase®核酸內切酶效力
基于Benzonase®核酸內切酶的DNA消化應當使用宿主細胞DNA的100- 200堿基對片段的特定qPCR方法進行監(jiān)測。完整的DNA經過Benzonase®核酸內切酶消化后降解成3到5個堿基對的片段，限制熒光DNA嵌入染料測定的效用，后者可檢測小至4個堿基對的DNA片段。建議選擇合適的對照實驗來確定消化工藝過程，從而確保穩(wěn)健的結果。
DoE結果和后續(xù)步驟說明：
上表中建議的實驗設計是根據影響DNA/RNA消化的主要參數提出的建議�？筛鶕斍暗馁Y源，減少試驗次數或者增加更多的條件。一旦執(zhí)行設計，建議首先證實生成數據是否與最初實驗假設相一致。然后充分分析和解釋結果。這可能需要進一步的試驗或基于縮窄圍繞已確定最優(yōu)值的參數值范圍再進行DoE。此外，應考慮對生產工藝過程中的使用點（如在生物反應器中、細胞裂解后或澄清后）進行優(yōu)化，以實現Benzonase®核酸內切酶最具經濟性的表現。
適用于GMP生產的Benzonase®：
如您需要了解更多關于Benzonase®核酸內切酶，請點擊此處。
Benzonase®核酸內切酶——生物制藥生產中去除DNA的明智選擇，其價值已在過去的30多年里予以了證明。使用Benzonase®核酸內切酶的生產遵循GMP (ICH Q7)，從而提供了高質可靠的產品，以此平衡工藝的高效性和法規(guī)的要求。所有Benzonase®核酸內切酶產品具有相同的核酸序列（經LC-MS/MS質譜分析證實）、穩(wěn)健性和活性。
作為一種沒有堿基偏好性的核酸內切酶，它們可以將DNA和RNA降解為3到5個堿基對(<6 kDa)的小片段，是監(jiān)管機構要求的病毒載體和疫苗生產中去除核酸的理想工具。使用Benzonase®核酸內切酶可進一步增加病毒純化的收率，保護下游層析和過濾裝置不受污染，并且降低料液粘度。
為什么要優(yōu)化Benzonase®核酸內切酶在生產工藝中的使用？
Benzonase®核酸內切酶是一款高質量產品，可為工藝帶來巨大價值。關鍵在于要以較經濟的方式使用它。由于Benzonase®核酸內切酶活性在很大程度上受到其所應用基質環(huán)境的影響，故其應用優(yōu)化應當是工藝開發(fā)中必不可少的關鍵步驟。
在本方案中，我們將提供如何規(guī)劃和建立Benzonase®核酸內切酶實驗設計（DoE）優(yōu)化實驗的指引。請注意，雖然在本方案中并未涉及Benzonase®核酸內切酶使用點（如在生物反應器中、細胞裂解后或澄清后操作）的優(yōu)化，但就整體優(yōu)化而言，則也應予以考慮。
優(yōu)化流程
1、DoE介紹
實驗設計(DoE)是指利用統(tǒng)計學規(guī)劃、實施和分析多個因子對一個或一組參數的影響。DoE是一種強大的工具，可用于各種實驗情況，如優(yōu)化酶的反應條件。為Benzonase®核酸內切酶的應用建立DoE，有助于找到最佳操作條件，達到工藝中所需的DNA清除率。
2、DoE設計
為了建立符合DoE概念的實驗系列，建議首先定義常數因子、具有中心點起始條件的輸入變量和輸出參數。
① 定義常數因子
✦需已知樣品材料的平均DNA載量，用于計算所需酶量；
✦由于病毒生產上游工藝的材料成分復雜，應用也各不相同，但Benzonase®核酸內切酶的優(yōu)化目標是一致的。因此，可將其視為常數因子，以及由培養(yǎng)環(huán)境產生的pH值和鹽濃度也可視為常數因子。有關不同化學品對Benzonase®核酸內切酶性能的影響概述，請參考我們的產品手冊；
✦由于Mg2+濃度是Benzonase®核酸內切酶發(fā)揮作用的最關鍵參數，因此應始終保持2mM的常量；
✦培養(yǎng)容器和混合工藝過程應始終保持不變。
② 定義輸入變量
平衡Benzonase®核酸內切酶的作用效果取決于：
✦Benzonase®濃度
✦孵育時間
✦孵育溫度
③ 定義輸出
由于Benzonase®核酸內切酶應用的目標是DNA消化，因此關鍵輸出為：
✦DNA含量>100 bp片段
✦產品完整性
3、已定義變量的中心點起始條件
建議設置以下起始點：
✦孵育時間設置為2個小時
✦孵育溫度設置為室溫，如21°C
Benzonase®核酸內切酶在標準測定條件下的理論濃度，根據下列公式，基于各樣品材料的DNA含量得出：
4、DoE實驗方案
下表建議Benzonase®核酸內切酶優(yōu)化實驗設置的第一種方法。這種方法選擇三種溫度條件，分別為37°C、室溫和4°C，同時選擇1、2、6個小時的三種典型培養(yǎng)時間。結合三種Benzonase®核酸內切酶濃度，是理論濃度的x倍。
5、檢測Benzonase®核酸內切酶效力
基于Benzonase®核酸內切酶的DNA消化應當使用宿主細胞DNA的100- 200堿基對片段的特定qPCR方法進行監(jiān)測。完整的DNA經過Benzonase®核酸內切酶消化后降解成3到5個堿基對的片段，限制熒光DNA嵌入染料測定的效用，后者可檢測小至4個堿基對的DNA片段。建議選擇合適的對照實驗來確定消化工藝過程，從而確保穩(wěn)健的結果。
DoE結果和后續(xù)步驟說明：
上表中建議的實驗設計是根據影響DNA/RNA消化的主要參數提出的建議�？筛鶕斍暗馁Y源，減少試驗次數或者增加更多的條件。一旦執(zhí)行設計，建議首先證實生成數據是否與最初實驗假設相一致。然后充分分析和解釋結果。這可能需要進一步的試驗或基于縮窄圍繞已確定最優(yōu)值的參數值范圍再進行DoE。此外，應考慮對生產工藝過程中的使用點（如在生物反應器中、細胞裂解后或澄清后）進行優(yōu)化，以實現Benzonase®核酸內切酶最具經濟性的表現。
適用于GMP生產的Benzonase®：
如您需要了解更多關于Benzonase®核酸內切酶，請點擊此處。
