活細胞顯微成像系統(tǒng)硬件觸發(fā)方案的簡要探討五問匯總

一、顯微鏡各組件工作方式及為什么需要硬件觸發(fā)？

廣州科適特科學儀器有限公司在為客戶提供顯微鏡及配件和服務過程中，經(jīng)常有客戶問到為什么顯微鏡需要做硬件觸發(fā)？為了幫助客戶更好的理解顯微鏡，我們整理了此文簡單探討�；罴毎�成像實驗現(xiàn)在需要比以往更高的速度和更多的數(shù)據(jù)處理量。本文以尼康顯微鏡為例簡單介紹通過硬件之間的直接信號觸發(fā)顯微成像設備。這樣可以盡量地減少延遲，使設備同步并減少光對樣品的照射。本文簡要說明了尼康的NIS-Elements觸發(fā)工作流程和工作方式，并詳細介紹了其對于常見的時間序列采集中的好處。

顯微鏡成像系統(tǒng)是由幾個硬件設備一起工作的組合。這些設備可能包括XY電動平臺，Z軸聚焦驅(qū)動器，壓電快速XY​​或Z驅(qū)動器，電動濾光片輪，光源（落射熒光和透射光）以及檢測器。軟件控制著這些設備的移動，因此在理想的環(huán)境中，檢測器的曝光時間將成為實驗速度的限制因素。
然而，大部分情況下，當使用軟件控制設備移動時，無法達到理想的速度。許多具有不同固有速度的設備速度偏差使得顯微鏡軟件必須通過一系列命令和回調(diào)來調(diào)解設備移動和圖像捕獲。結(jié)果，由于與軟件的交互而產(chǎn)生了速度延遲。對于單個圖像或簡單的實驗，延遲可能不那么明顯，但是對于大數(shù)據(jù)實驗，這種延遲對總體采集時間的影響可能會非常顯著。
主機上的定時時鐘頻率最終決定顯微鏡的性能。因此，在同一臺計算機上管理的多個進程很容易影響主機的高精度定時。
 
二、解決方案舉例：通過NIS-Elements中的直接硬件觸發(fā)來繞過軟件延遲
當今大多數(shù)高性能檢測器和外圍設備都具有I / O（輸入和輸出）端口，用于直接電壓信號的設備力學控制。例如，大多數(shù)光源具有直接的模擬和TTL（晶體管-晶體管邏輯電路）控制連接器，以及通常的串行通信。但是，商用顯微鏡軟件包通常使用串行通信，該通信僅依賴于計算機時鐘和軟件控制。
尼康的NIS-Elements軟件已經(jīng)使用I/O連接已有相當長的一段時間了，并且會繼續(xù)擴展其功能。該軟件通過使用這些功能提供硬件觸發(fā)功能。直接I/O電壓信號的連接來實現(xiàn)快速驅(qū)動設備。設備控制與信號采集的同步至關(guān)重要。所有這些信號都是通過數(shù)字采集接口（DAQ）進行管理，以實現(xiàn)靈活性和便利性。 National Instruments數(shù)據(jù)采集設備（NIDAQ）上的定時時鐘也比主機PC的定時時鐘精確得多。為此，NIS-Elements支持National Instruments NIDAQmx系列設備。 圖1通過直接的硬件觸發(fā)，曝光信號以及相關(guān)設備的運動情況。該圖顯示了通過硬件觸發(fā)光源，電動濾光輪和Z軸電動馬達控制進行五通道信號采集的示例。 NIDAQ監(jiān)測相機的曝光。 NIDAQ輸出信號控制激發(fā)波長和持續(xù)時間，以使它們出現(xiàn)在透射（Tx）光或UV，藍色，綠色或紅色激發(fā)波長的時間流逝的后續(xù)幀中。曝光后還會顯示發(fā)射（Em）濾光輪的位置，由于該設備的速度較慢，因此移動持續(xù)時間以紅色表示。請注意，在檢測器沒有曝光觸發(fā)時候，各個部件移動的時鐘是同步的。最后，壓電Z軸馬達的位置跟曝光信號以及幀數(shù)相關(guān)，因此僅在完成一幀循環(huán)后才發(fā)生移動。
 
三．NIS-Elements如何執(zhí)行硬件觸發(fā)
通過NIDAQ監(jiān)測到檢測器曝光信號，并且連接好了外圍硬件設備，硬件觸發(fā)變得很容易理解了。一個定義多維實驗的參數(shù)，然后NIS-Elements設置運行的順序。一旦檢測器開始工作，NIDAQ便會在兩次曝光之間移動硬件設備并在曝光期間控制照明。在這種安排下，檢測器將主控（Master）信號提供給NIDAQ，而NIDAQ協(xié)調(diào)所有其他外設的時鐘和順序（圖1）。
NIDAQ可以進行精確的照明控制，只有在檢測器曝光時才打開光源，而在照相機不進行曝光時（包括在檢測器的讀出時間內(nèi)），光源會立即關(guān)閉。此外，NIDAQ甚至可以自定義曝光應在照明內(nèi)激活多長時間，并且還可以對照明進行脈沖控制。這種控制減少了照明的持續(xù)時間，從而將時間保持在絕對最短的時間。對于LED或激光源，開/關(guān)時間在數(shù)十微秒的范圍內(nèi)。例如目前應用最多的CoolLED公司的pE-4000和pE-300光源切換時間可以達到20微秒。
硬件觸發(fā)還可通過同時啟動所有設備來有效執(zhí)行多設備控制。并行觸發(fā)提高了整體速度，因為沒有順序執(zhí)行一個設備移動另一個設備的操作。設備的定時和速度也是已知的，因此NIS-Elements甚至可以以重疊（“實時”）采集模式運行的檢測器的讀出時間內(nèi)控制設備移動，在這種模式下，檢測器始終在運行。

四、簡單經(jīng)濟的快速觸發(fā)解決方案-CoolLED “Sequence Runner”
 
2020年10月14日，英國Andover–全球LED顯微鏡照明專家CoolLED推出了其新型8通道pE-800 LED照明系統(tǒng) 用于寬視野熒光顯微鏡。 pE-800具有八個可獨立控制的LED和閃電般的快速TTL切換功能，以最低的總擁有成本提供了最高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。獨特的8通道Sequence Runner結(jié)合使用時，照明序列可以通過相機中的單個TTL觸發(fā)，從而將手動顯微鏡轉(zhuǎn)變?yōu)閮r格合理且功能強大的八通道自動成像系統(tǒng)。
 
8通道Sequence Runner,通過單個TTL輸入（例如從攝像頭TTL輸出）通過全局TTL快速控制和同步切換選定的LED及其輻照度，切換速度<7 µs。需要較少的電子硬件。NIS Elements已經(jīng)集成Sequence Runner，如果沒有配置NiDAQ板，這將是一個非常經(jīng)濟高效的解決方案。
五、強大的硬件觸發(fā)的顯微鏡主機架
徠卡DMi8或者奧林巴斯IX83及尼康公司的Ti2-E等倒置顯微鏡擴大了硬件觸發(fā)的潛力，Ti2-E倒置顯微鏡支架上的所有電動組件都具有硬件觸發(fā)或減少延遲的優(yōu)勢。Ti2-E的關(guān)鍵功能包括本地直接連接檢測器的功能（即使沒有NIDAQ）：顯微鏡本身知道曝光何時完成并立即執(zhí)行下一個設備的動作。這提供了一些令很好的功能，例如非�？焖俚淖詣訉�焦功能。包含NIDAQ也可以通過直接硬件觸發(fā)來啟動顯微鏡硬件，從而允許定制的觸發(fā)配置包括顯微鏡硬件和第三方設備。例如，透射光和落射熒光光源，二向色鏡，壓電Z軸驅(qū)動馬達和發(fā)射濾片轉(zhuǎn)盤都可以一起控制。

尼康顯微鏡系統(tǒng)如果需要實現(xiàn)硬件觸發(fā)功能，需要配置NIS-Elements AR，C和HC軟件包，NIDAQ和用于觸發(fā)設備控制的插件。NIS-Elements軟件可以管理越來越多的硬件觸發(fā)的設備類型（表1），包括CoolLED光源，驅(qū)動馬達，照明模塊，傳感器和信號發(fā)生器。所有這些設備都可以用于基本的多維采集實驗，但也可以用于刺激/激活實驗，高容量獲取實驗以及自定義實驗流程（例如光源照明順序），使用戶以完全靈活地控制觸發(fā)的設備控件，實驗順序和模式。 表1| NIS Elements硬件觸發(fā)的設備類別

借助尼康的NI觸發(fā)盒（NI-BB）（圖2）等外圍設備即可輕松進行硬件觸發(fā)的設備配置，NI觸發(fā)盒設備包括一個NIDAQ和一個專用分線盒，帶有預定義的連接器和電纜，用于XYZ設備，熒光光源，透射光的LED，濾光片轉(zhuǎn)輪，激光單元，光刺激設備和Ti2-E觸發(fā)的顯微鏡支架。 NIS-Elements設備管理器可以很方便的根據(jù)所使用的連接器將NIDAQ的資源分配給每個連接的設備。檢測器（最多三個）也可以輕松連接到控制箱。 圖2 |尼康NI-BB套件通過預定義的連接器電纜直接連接各種硬件設備，以便直接觸發(fā)控制。簡化了外圍設備和NIDAQ的軟件設置。
 
六、小結(jié)
尼康的NIS-Elements硬件觸發(fā)是一種功能強大而有效的方案，可盡量地減少樣品在光源下的照射時間，減少或消除兩次激發(fā)之間的時間延遲，并大大減少整個實驗時間。表2中顯示了一些典型的實驗示例，比較了相同硬件和設置。區(qū)別是在Ti2-E倒置顯微鏡上使用直接硬件觸發(fā)和顯微鏡曝光終端感應功能的軟觸發(fā)。
硬件觸發(fā)可顯著縮短整體實驗時間。在大多數(shù)這些示例中，相機的曝光時間長于相機的讀取時間。最后一行是一個比較，其相機曝光時間與其讀數(shù)相同時間，并且攝像頭能夠在完全重疊（100％占空比）模式下運行。

在采購顯微鏡系統(tǒng)時，可以考慮將要使用的外圍設備。具有I/O觸發(fā)功能的設備（即使最初不使用）也提供了內(nèi)置的升級途徑。用于硬件觸發(fā)的NI-Elements軟件控件花費很小，而且配置簡單。采用硬件觸發(fā)功能的實驗設計和控制既合理又簡化，用戶只需觸摸一下按鈕，即可保存和調(diào)用觸發(fā)的設備配置。