胎牛血清使用中的常見FAQ

胎牛血清在生物醫(yī)學(xué)研究，以及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域中，應(yīng)用廣泛。胎牛血清含有豐富的生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)和其他生物分子，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖具有重要作用。所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生極大的影響。

下面將針對(duì)血清如何儲(chǔ)存、融化、為何出現(xiàn)沉淀以及如何減少沉淀做出詳細(xì)分析。希望能幫助您解決血清使用上出現(xiàn)的問題。

Q1. 血清長(zhǎng)期儲(chǔ)存的條件和方法

血清如需長(zhǎng)期保存，則必須儲(chǔ)存于-10℃或更低溫冰箱中，建議存放于-20℃的冰箱中。研究表明儲(chǔ)存在-80℃條件下的血清在性能方面變化不大，但由于解凍時(shí)溫差過大，會(huì)導(dǎo)致析出更多沉淀，使得背景雜亂，因此血清長(zhǎng)期保存不建議處于-80℃條件下。如果近期會(huì)頻繁使用血清，我們建議不要在4℃條件下存放超過1個(gè)月，若一次無法用完整瓶建議分裝后保存，且要避免反復(fù)凍融。另外，血清冰凍后體積會(huì)增加約10%，因此血清分裝時(shí)請(qǐng)留意預(yù)留一定的體積空間。

Q2. 如何進(jìn)行血清的程序性解凍？

程序性解凍血清可以確保血清制品質(zhì)量的穩(wěn)定性，且不會(huì)因?yàn)闇夭钸^大而析出過多蛋白等沉淀。程序性解凍方法是于實(shí)驗(yàn)開始之前將冷凍的血清置于4℃冰箱中融解，并且在解凍過程中每隔1小時(shí)搖勻一次，使溫度與成分均一，減少沉淀析出，直至全部解凍，然后再移入室溫條件下使用。

Q3.血清解凍后發(fā)現(xiàn)絮狀沉淀該如何處理？

造成血清發(fā)生絮狀沉淀的原因主要是血清解凍過程中溫差帶來了脂蛋白變性和纖維蛋白析出，沉淀本身不會(huì)影響血清質(zhì)量，也不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。但如必須處理沉淀，則可通過離心方式去除，如500-1000×g離心5-10 min。

Q4.血清沉淀是什么？

血清非人工產(chǎn)品，沉淀出來系自然現(xiàn)象，沉淀主要是纖維蛋白原，其次是鹽析出。如磷酸鈣等，還有一些膽固醇和脂肪酸以及其他蛋白析出物質(zhì)等。

沉淀不會(huì)影響其對(duì)細(xì)胞的促生長(zhǎng)作用：技術(shù)人員對(duì)此問題有過深入研究證明，血清沉淀對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒有影響，但有一個(gè)例外：沉淀對(duì)巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)會(huì)有一些影響。
 

Q5.哪些因素血清沉淀會(huì)增加？

血清熱滅活、37℃培養(yǎng) 、反復(fù)凍融、溶解過程中沒有搖勻、伽馬射線照射、長(zhǎng)期存放在 2-8°C、血清加入到RPMI 1640中時(shí)、pH升高時(shí)、在培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基的蒸發(fā)等等因素都會(huì)導(dǎo)致沉淀的增加。
 

Q6. 如何避免血清中產(chǎn)生沉淀？

1.解凍時(shí)，請(qǐng)隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一；
2.分裝凍存時(shí)，須規(guī)則搖晃均勻（小心勿造成氣泡）；
3.切勿由-20℃直接至37℃水浴鍋解凍，較大的溫差，易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀；
4.切勿將血清置于37℃過長(zhǎng)時(shí)間，否則可能使之渾濁，其中一些不穩(wěn)定的組分也會(huì)因此受到影響，最終降低血清的品質(zhì)；
5.血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟；
6.若必須做血清的熱滅活，請(qǐng)遵守56℃，30分鐘的原則，并且保持搖晃均勻。溫度過高、時(shí)間過久或搖晃不均勻，都會(huì)造成沉淀物的增多。

 

Q7.血清中的小黑點(diǎn)是什么？

血清解凍過程溫差過大、經(jīng)反復(fù)凍融或通過熱滅活處理后更容易產(chǎn)生沉淀，這些沉淀物在鏡下觀察時(shí)有一些會(huì)呈現(xiàn)以布朗運(yùn)動(dòng)的小黑點(diǎn)，業(yè)內(nèi)流行一種“黑膠蟲”污染的說法，但“黑膠蟲”一直以來都是極為神秘的存在，至今科學(xué)家們也沒有完整的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以證實(shí)它究竟是一種生物還是非生物，更有人認(rèn)為“黑膠蟲”是血清的原蟲，或誤以為是細(xì)菌或真菌污染。但科學(xué)家通過進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)它們更可能是血清中的蛋白結(jié)晶。這種結(jié)晶可能為蛋白析出，如纖維蛋白原凝結(jié)成纖維蛋白；或是鹽析出，如磷酸鈣等；也有一些是膽固醇和脂肪酸。以下圖片就證實(shí)了這一說法，如纖維蛋白和磷酸鈣。
 

Q8.血清是否需要熱滅活處理?

血清是否需要滅活取決于您的應(yīng)用。加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng)ES 細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。

熱滅活是指56℃， 30分鐘加熱已徹底凍結(jié)的血清。加熱過程中須規(guī)矩?fù)u晃均勻。目的是使血清中的補(bǔ)體成分(complement)滅活。除非有必要，一般不建議做此熱處理，因?yàn)闊崽幚頃?huì)形成血清沉積增多，而且還會(huì)影響血清的質(zhì)量。補(bǔ)體參與反應(yīng)有: 平滑肌細(xì)胞收縮、 肥大細(xì)胞和血小板釋放組胺、 增強(qiáng)吞噬作用、促進(jìn)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞發(fā)作化學(xué)趨化和活化。相關(guān)研究的使用者可以考慮血清增加熱滅活處理。
 

Q9.如何進(jìn)行血清滅活處理？  

血清請(qǐng)先按上述「血清應(yīng)如何融解」中的操作步驟融化和混勻，熱滅活時(shí)請(qǐng)將血清置于 56 ℃ 水浴 30 分鐘。為盡量減少熱滅活對(duì)血清品質(zhì)的影響，一次滅活的血清體積不宜過大。最好準(zhǔn)備同樣的容器裝相等體積的水（與血清相同溫度），滅活時(shí)將裝有血清和水的容器同時(shí)放入 56 ℃ 水浴, 在裝水的容器中放置溫度計(jì)，加熱過程中不時(shí)輕輕旋轉(zhuǎn)混勻血清，當(dāng)溫度計(jì)顯示達(dá)到 56 ℃ 左右，開始計(jì)時(shí)。56 ℃ 水浴后，建議馬上轉(zhuǎn)移到冰上降溫。
 

Q10.血清在4度冰箱能放多久？對(duì)細(xì)胞有何影響呢？  

根據(jù)文獻(xiàn)顯示血清和血漿在4℃條件儲(chǔ)存2小時(shí)，血清中的成分就會(huì)發(fā)生變化，所以建議用戶在使用血清要分裝成自己常用的規(guī)格，建議現(xiàn)配現(xiàn)用。如果不能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)配現(xiàn)用的話，配好的完全培養(yǎng)基在4℃保存的時(shí)間不要超過1周，如果期間使用頻次較高或恢復(fù)室溫次數(shù)較多時(shí)，能夠保存的時(shí)間還會(huì)減少。
 

Q11.血清使用濃度是多少?

原則上血清添加量不要太多，通常分為5%、10%、20%幾檔，部分細(xì)胞原代提取時(shí)會(huì)使用20%血清，大部分細(xì)胞正常培養(yǎng)時(shí)會(huì)使用10%的血清濃度。至于某一株細(xì)胞適應(yīng)什么樣的血清濃度，還需要根據(jù)細(xì)胞特性、實(shí)驗(yàn)?zāi)康淖鰷y(cè)試和調(diào)校。
 

Q12.如何選擇批間差小的胎牛血清？

血清批間差是客觀存在的，因?yàn)檠�清制品來源于天然活體，供體牛只的生理狀況、健康狀況均不同，且受飼養(yǎng)環(huán)境的地形、風(fēng)貌、飲食、水源等影響，體內(nèi)各類蛋白、生長(zhǎng)因子和酶類的含量均有巨大差異，所以血清具有含量復(fù)雜且不固定的特性，批間差異也是有可能的，因此選擇批間差異小的血清不僅可以保證血清質(zhì)量，確保細(xì)胞培養(yǎng)效果，還能減少由于批間差異帶來的使用前測(cè)試，且避免實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不可重復(fù)性。