多光子成像技術(shù)的發(fā)展歷程及應(yīng)用

在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，了解微觀世界的奧秘對于攻克疾病、探索生命本質(zhì)至關(guān)重要。光學(xué)成像技術(shù)作為重要的研究手段，不斷推陳出新。其中，新型多光子成像技術(shù)近年來發(fā)展迅猛，為科研人員和醫(yī)療工作者提供了更為強大的觀測工具。它能夠深入活體組織內(nèi)部，獲取高分辨率的圖像，幫助我們窺探細胞和組織的細微結(jié)構(gòu)與動態(tài)變化。

研究背景與技術(shù)挑戰(zhàn)
傳統(tǒng)光學(xué)成像的局限
傳統(tǒng)光學(xué)成像技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷中發(fā)揮了重要作用，但也存在諸多局限性。例如，在觀察深層組織時，光的散射和吸收會導(dǎo)致成像質(zhì)量下降，分辨率降低，難以清晰呈現(xiàn)組織內(nèi)部的微觀結(jié)構(gòu)。而且，傳統(tǒng)成像技術(shù)可能對組織造成較大的光損傷，影響細胞的正常生理功能，干擾研究結(jié)果的準確性。這些局限限制了我們對生物體內(nèi)復(fù)雜過程的深入理解，迫切需要新的成像技術(shù)來突破這些瓶頸。

多光子成像技術(shù)的興起
隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進步，多光子成像技術(shù)應(yīng)運而生。它基于多光子吸收原理，與傳統(tǒng)成像技術(shù)相比，具有獨特的優(yōu)勢。多光子成像能夠有效減少光散射和吸收，降低組織光損傷，提高成像的信噪比，并且具備良好的光學(xué)層析成像能力，為生物醫(yī)學(xué)研究帶來了新的希望。接下來，我們將詳細介紹幾種新型多光子成像技術(shù)。

技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用
微型化雙光子熒光成像技術(shù)
技術(shù)原理與發(fā)展歷程：微型化雙光子熒光成像技術(shù)是為滿足對神經(jīng)系統(tǒng)在體研究的需求而發(fā)展起來的。神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，研究其活動需要在盡量保持其完整性的情況下進行成像。雙光子熒光成像利用近紅外光激發(fā)，具有深組織穿透性、光學(xué)切片能力以及較小的光毒性和光漂白等優(yōu)勢，成為無創(chuàng)在體腦顯微成像的首選。第一臺微型化雙光子顯微鏡原型機于2001年問世，采用單模光纖尖端掃描，但存在質(zhì)量重、掃描頻率受限和難以批量生產(chǎn)等問題。2006年，微機電系統(tǒng)（MEMS）掃描鏡被引入，一定程度上改善了性能，但仍存在無法對重要熒光探針成像和實際工作性能不佳等問題。

攜帶式雙光子顯微鏡
最新進展與優(yōu)勢：北京大學(xué)程和平課題組報道的高速高分辨微型化雙光子顯微鏡（FHIRM-TPM）代表了該技術(shù)的最新進展。它采用MEMS掃描鏡設(shè)計，對配件進行改進和創(chuàng)新，這款顯微鏡重量僅2.15g，橫向分辨率和軸向分辨率分別提升約一倍，能有效激發(fā)常用熒光指示劑，可在小鼠活躍運動狀態(tài)下長時間穩(wěn)定工作。

應(yīng)用領(lǐng)域：微型化雙光子顯微鏡主要用于腦成像，能夠在動物自由活動狀態(tài)下研究神經(jīng)活動，為神經(jīng)科學(xué)研究提供了有力工具。未來，它有望拓展應(yīng)用于更多組織成像，通過更換物鏡適應(yīng)不同成像需求，還可與微創(chuàng)方法結(jié)合實現(xiàn)更深層腦成像，或借助新興三光子技術(shù)提升成像效果。

雙光子光纖內(nèi)窺成像技術(shù)
技術(shù)優(yōu)勢與分類：雙光子光纖內(nèi)窺成像技術(shù)為早期癌癥局部微創(chuàng)診斷提供了新途徑。雙光子激發(fā)只發(fā)生在焦點附近，激發(fā)光波長更長，散射更少，能穿透更深標本，提高圖像對比度，還可通過分析非線性信號了解內(nèi)部器官生理、病理變化。該技術(shù)的內(nèi)窺鏡按光纖類型分為單模光纖（SMF）、光子晶體光纖（PCF）和雙包層光纖（DCF）。單模光纖最早應(yīng)用，但存在脈沖變寬和難以收集非線性信號的缺點。光子晶體光纖能提高激發(fā)光束傳遞和非線性信號采集效率，雙包層光纖便于實現(xiàn)內(nèi)窺鏡微型化。

掃描裝置與發(fā)展成果：研究者通過改良掃描裝置提高成像速度和質(zhì)量，多種微型掃描機構(gòu)已被應(yīng)用。隨著技術(shù)發(fā)展，雙光子內(nèi)窺成像在科研和臨床應(yīng)用中取得較大進展，如對癌細胞成像、大腦深部成像、上皮組織成像以及對大鼠食管組織和尾腱成像等。

最新進展與應(yīng)用前景：2017年，Liang WX等人實現(xiàn)了具有亞細胞層次分辨率的光纖內(nèi)窺平臺，可對活體內(nèi)生物組織進行無標記雙光子代謝成像。該裝置在光纖、物鏡和激發(fā)效率等方面進行改進，提高了檢測靈敏度、空間分辨率和圖像質(zhì)量，整體信噪比提高20-50倍。它能夠監(jiān)測急性小鼠腎缺血再灌注體內(nèi)模型中腎皮質(zhì)小管的氧化還原率變化，展現(xiàn)了高分辨率和高靈敏度。未來，雙光子光纖內(nèi)窺成像技術(shù)將朝著提高成像速度和信噪比的方向發(fā)展，在臨床實踐中的應(yīng)用也將更加廣泛。

三光子成像技術(shù)
發(fā)展歷程與原理：三光子成像技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了漫長過程。研究者們很早就觀察到三光子吸收激發(fā)熒光現(xiàn)象，1979年Catalano等人對無機材料的三光子非線性光學(xué)性質(zhì)進行定量分析，1995年Davey等人在有機高分子聚合物溶液中觀察到三光子激發(fā)熒光現(xiàn)象并提出應(yīng)用設(shè)想。隨后，一系列研究驗證了三光子成像的能力，但受光源技術(shù)和成本限制，發(fā)展較為緩慢。直到2013年，Horton等人報道了使用基于孤子自頻移（SSFS）光源的三光子顯微鏡，使三光子成像取得重要突破。

與雙光子成像的比較：與雙光子成像相比，三光子成像使用波長更長的激發(fā)光源，成像深度更大。這是因為長波激發(fā)光在組織中的散射更低，且1600-1800nm的激發(fā)光可避開組織中水對紅外光的吸收峰。同時，三光子吸收需要更高激光能量，能進一步削弱非焦平面的背景信號，提高信號-背景比（SBR），獲得更高質(zhì)量圖像。不過，三光子成像也存在缺陷，如對高能激發(fā)光需求導(dǎo)致設(shè)備成本和技術(shù)難度增加，強激光可能對組織造成損傷。

應(yīng)用領(lǐng)域與發(fā)展方向：目前，三光子成像主要應(yīng)用于活體組織高分辨成像和光遺傳學(xué)研究等領(lǐng)域，未來有望應(yīng)用于臨床光學(xué)治療。為克服現(xiàn)有缺陷，研究人員正通過開發(fā)新型熒光染料、尋找合適激光光源和優(yōu)化探測器等方法，提高三光子成像深度、分辨率和信號強度。

成像實驗與結(jié)果分析
微型化雙光子顯微鏡的成像實驗
微型化雙光子顯微鏡（如FHIRM-TPM）在腦成像實驗中表現(xiàn)出色。在對小鼠的研究中，它能夠清晰捕捉小鼠活躍運動狀態(tài)下神經(jīng)元的活動情況。通過有效激發(fā)熒光，科研人員可以觀察到神經(jīng)元的形態(tài)和功能變化，為研究神經(jīng)回路的動態(tài)過程提供了直觀的數(shù)據(jù)。與傳統(tǒng)臺式雙光子顯微鏡相比，F(xiàn)HIRM-TPM的高分辨率和高掃描速度，使其能夠更精準地記錄神經(jīng)元活動的時空信息，有助于深入理解神經(jīng)系統(tǒng)的工作機制。

雙光子光纖內(nèi)窺成像實驗
雙光子光纖內(nèi)窺成像技術(shù)在生物組織代謝成像方面成果顯著。以對急性小鼠腎缺血再灌注體內(nèi)模型的研究為例，通過無標記雙光子內(nèi)窺技術(shù)監(jiān)測腎皮質(zhì)小管的氧化還原率變化。實驗結(jié)果顯示，缺血時NADH濃度增加，氧化還原比下降，再灌注后恢復(fù)正常。從成像圖像中可以清晰看到，缺血后紅色區(qū)域氧化還原比下降，再灌注后紅色區(qū)域變成綠色，直觀展示了雙光子內(nèi)窺顯微成像的高分辨率和高靈敏度，為研究腎臟生理病理過程提供了有力依據(jù)。

三光子成像實驗
三光子成像技術(shù)在大腦成像實驗中展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢。使用基于SSFS光源的三光子顯微鏡對小鼠大腦進行成像，可以無損地看到大腦灰質(zhì)之下的白質(zhì)。與雙光子成像相比，三光子成像能夠穿透更深的組織，獲得更清晰的深層結(jié)構(gòu)圖像。在對神經(jīng)元和腦血管的成像中，三光子成像的高SBR使得圖像中的細節(jié)更加豐富，有助于研究人員深入了解大腦的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系，為神經(jīng)科學(xué)研究開辟了新的視角。

總結(jié)與展望
新型多光子成像技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域意義重大。微型化雙光子成像技術(shù)讓科學(xué)家能在動物自由活動時研究神經(jīng)系統(tǒng)，為解開大腦奧秘提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)，推動神經(jīng)科學(xué)發(fā)展，未來有望拓展到更多組織成像，幫助理解多種生理病理過程。雙光子內(nèi)窺成像技術(shù)可實現(xiàn)無創(chuàng)或微創(chuàng)的體內(nèi)檢測，提高疾病早期診斷準確性，降低患者痛苦和醫(yī)療成本，未來提高成像速度和信噪比后，將在臨床廣泛應(yīng)用，助力疾病早篩和精準治療。三光子成像技術(shù)憑借大成像深度和高SBR，在研究深層組織和細胞結(jié)構(gòu)功能方面優(yōu)勢明顯，隨著技術(shù)完善，有望為臨床光學(xué)治療提供新方法，提高治療效果。

論文信息
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
石玉潔, 張廣杰, 陸政元, 應(yīng)亞宸, 賈薈琳, 席鵬. 新型多光子成像技術(shù)研究進展[J]. 中國光學(xué)（中英文）, 2018, 11(3): 296-306. 
DOI:10.3788/CO.20181103.0296.