關(guān)于阿爾茨海默癥β-淀粉樣蛋白的7大常見檢測(cè)方法總結(jié)

阿爾茨海默癥 (AD) 屬于老年癡呆癥的一種，是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，其機(jī)制主要涉及 β-淀粉樣蛋白斑塊 (Amyloid-β, Aβ) 等。本期小 M 給大家介紹幾種針對(duì) Aβ 的生物檢測(cè)方法！ 

Section.01
Aβ 的常見生物檢測(cè)方法

針對(duì) Aβ 檢測(cè)的生物實(shí)驗(yàn)方法有多種，從 ELISA 和 Western Blot 的精準(zhǔn)定量，到質(zhì)譜分析的高分辨率檢測(cè)，再到 IHC 的組織分布觀察，這些技術(shù)揭示關(guān)鍵蛋白 Aβ 的奧秘，助力 AD 研究!

 
Section.02
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

研究表明，AD 患者腦脊液 (CSF) 的 Aβ42 水平的變化一般發(fā)生在臨床癥狀出現(xiàn)前 10-20 年，而血液中與 AD 相關(guān)的生物標(biāo)志物豐度非常低，因此需要超靈敏的檢測(cè)技術(shù)來(lái)量化 Aβ42 水平。通過(guò) 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (ELISA) 和其他常規(guī)免疫測(cè)定法測(cè)定顯示，AD 患者 CSF 中的 Aβ42 濃度降低，這可能與大腦中的血腦屏障和清除系統(tǒng)有關(guān)。而利用免疫磁還原 (IMR) 技術(shù)檢測(cè)顯示 AD 早期患者血液 Aβ42 水平升高，特別是 AD 引起的輕度認(rèn)知障礙 (圖 1)^[1]。

圖 1. 對(duì)照組 (CONT)  和 AD 組血漿 Aβ42 和 CSF Aβ42 水平呈負(fù)相關(guān)^[1]。

01
小貼士

ELISA 基本原理：將一定濃度的抗原或抗體通過(guò)物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待測(cè)樣本，通過(guò)酶標(biāo)物顯色的深淺間接反映被測(cè)抗原或者抗體是否存在或量的多少。

IMR 基本原理：利用分散在水中之披覆有抗原或抗體的磁性粒子與待測(cè)生物分子結(jié)合后，形成磁性粒子叢集或造成磁性粒子變大變重，再量測(cè)因這些磁性粒子叢集或大磁性粒子的形成而改變?cè)噭┐判源笮。瑥亩鴻z測(cè)出待測(cè)生物分子濃度的新穎檢測(cè)方式。

Section.03
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

Aβ 寡聚體是在 Aβ 聚集過(guò)程中早期的致病分子形式和神經(jīng)毒性物質(zhì)。由于 Aβ 寡聚體異質(zhì)且瞬時(shí)存在，光誘導(dǎo)未修飾蛋白質(zhì)交聯(lián) (PICUP) 反應(yīng)可有效的交聯(lián)得到 Aβ40/Aβ42 寡聚物，再通過(guò) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 量化其相對(duì)豐度。Aβ40 主要通過(guò)二聚體至四聚體進(jìn)行寡聚化，而 Aβ42 主要通過(guò)五聚體和六聚體進(jìn)行寡聚化^[2][3]，且隨著寡聚體增加而表現(xiàn)出強(qiáng)度降低 (圖 2a)。鑒于 SDS 影響 Aβ 的寡聚化狀態(tài)，電噴霧電離質(zhì)譜法 (ESI-IM-MS) 進(jìn)一步準(zhǔn)確表征低豐度 Aβ 寡聚體的分布 (圖 2b)^[4]。

圖 2. Aβ42 主要通過(guò)五聚體和六聚體進(jìn)行寡聚化^[4]。
a. 通過(guò) SDS-PAGE 分析表征 LMW 和 LMW_CL Aβ40 和 Aβ42 低聚物分布。b. LMW Aβ42 的 ESI-IM-MS 譜圖 。(M = 單體，D = 二聚體，Tr = 三聚體，Te = 四聚體，P = 五聚體，Hex/Hx = 六聚體。)

02
小貼士

PICUP基本原理：利用光能作為催化劑，驅(qū)動(dòng)特定的化學(xué)反應(yīng)，從而在無(wú)需修飾蛋白質(zhì)的情況下實(shí)現(xiàn)交聯(lián)。

SDS-PAGE基本原理：在 SDS-PAGE 中，加入十二烷基硫酸鈉（SDS）和強(qiáng)還原劑，SDS 破壞蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水相互作用，使其構(gòu)象改變，而還原劑打開蛋白質(zhì)內(nèi)的二硫鍵，使其分解為亞基。根據(jù)待測(cè)樣品中蛋白質(zhì)分子量大小的不同，使其在電泳膠中分離。

ESI-IM-MS基本原理：在毛細(xì)管的出口處施加高電壓，產(chǎn)生的高電場(chǎng)將從毛細(xì)管流出的液體霧化成微小的帶電液滴。隨著溶劑的蒸發(fā)，液滴表面的電荷強(qiáng)度逐漸增加，最后液滴分裂成一個(gè)或多個(gè)帶電離子，從而使分析物以單電荷或多電荷的形式進(jìn)入氣相變成氣相離子，再檢測(cè)產(chǎn)生高電荷離子的質(zhì)量電荷比。

Section.04
免疫組化

AD 的主要特征是老年斑 (SP) 和 神經(jīng)原纖維纏結(jié) (NFT) 在脆弱的大腦區(qū)域沉積。SP 在神經(jīng)元內(nèi)積累，由聚集的 Aβ40/42 肽組成。用 Aβ42 的 C 端特異性抗體對(duì)認(rèn)知障礙受試者中的腦組織染色，可以清晰的看到 AD 患者早期腦部組織顯示出大量的區(qū)域特異性神經(jīng)元內(nèi)免疫反應(yīng)性，尤其在海馬/內(nèi)嗅皮層等區(qū)域的錐體神經(jīng)元中 (圖 3)^[5]。

圖 3. Aβ42 在 AD 患者早期腦部組織中積累^[5]。
a. 神經(jīng)學(xué)正常的 3 歲患者（對(duì)照）海馬體 CA4 區(qū)域的 Aβ42 染色;只能看到微弱的神經(jīng)元染色。b. 一名患有唐氏綜合征的 3 歲兒童的明顯 CA4 Aβ42 免疫反應(yīng)性。c. 79 歲無(wú)癡呆患者的 Aβ42 染色 表明內(nèi)嗅皮層的 II 層神經(jīng)元（箭頭）有明顯的 Aβ42 細(xì)胞內(nèi)染色。d. 83 歲的認(rèn)知障礙受試者中，在 Aβ42 (RU) 染色的神經(jīng)元中明顯缺乏核內(nèi) Aβ42 染色; e. 72 歲的晚期 AD 受試者的“神經(jīng)元”形狀的老年斑 (SP)（箭頭）與更傳統(tǒng)的球形 SP 相鄰；f. 79 歲認(rèn)知障礙受試者的 CA1 區(qū)域顯示神經(jīng)元內(nèi) Aβ42 免疫反應(yīng)性和明顯的神經(jīng)元外彌漫性斑塊樣染色 (箭頭)。

03
小貼士

IHC 基本原理：融合免疫學(xué)原理 (抗原抗體特異性結(jié)合) 和組織學(xué)技術(shù) (組織的取材、固定、包埋、切片、脫蠟、水化等)，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色，來(lái)對(duì)組織 (細(xì)胞) 內(nèi)抗原進(jìn)行定位、定性及定量的研究 (主要是定位)。

Section.05
質(zhì)譜分析

Aβ40 在 AD 患者體內(nèi)的豐度是 Aβ42 的 10 倍，但 Aβ42 的神經(jīng)毒性比 Aβ40 強(qiáng)。用納米 ESI 離子遷移質(zhì)譜儀檢測(cè) Aβ40 和 Aβ42 的 1：1  混合物（用 FMOC 化學(xué)方法合成 Aβ40 和 Aβ42）發(fā)現(xiàn)，純 Aβ42 的寡聚化速度比 Aβ40 快得多，導(dǎo)致 Aβ42 快速耗盡 (圖 4a)^[6]。CSF 中 Aβ42 與 Aβ40 的比率有助于評(píng)估 AD，但定量受到包括分析前分析物損失等因素的限制。高通量 LCMS/MS 技術(shù)可以限制分析物損失，對(duì)臨床的 CSF 標(biāo)本分析顯示 AD 和輕度認(rèn)知障礙 (MCI) 患者中 Aβ42/Aβ40 比值和 Aβ42 濃度都降低^[15]，進(jìn)一步證實(shí) Aβ42 的寡聚化是 AD 的重要原因 (圖 4b)。

圖 4. Aβ42/Aβ40 比值和 Aβ42 濃度在 AD 和 MCI 患者中都降低^[7]。
a. Aβ40 和 Aβ42 的 1：1 混合物的負(fù)離子質(zhì)譜^[14]。b. Aβ42/Aβ40（上）和 Aβ42（下）在 AD、MCI、DLB/AD、健康對(duì)照、非 AD 癡呆和伴或不伴 AD 的 DLB 中的分布 (MCI：輕度認(rèn)知障礙；DLB：路易體癡呆)。

04
小貼士

LCMS/MS 基本原理：樣品通過(guò)液相色譜分離后的各個(gè)組分依次進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器，各組分在離子源被電離，產(chǎn)生帶有一定電荷、 質(zhì)量數(shù)不同的離子。不同離子在電磁場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)行為不同，采用質(zhì)量分析器按不同質(zhì)荷比（m/z）把離子分開，得到依質(zhì)荷比順序排列的質(zhì)譜圖。

Section.06
免疫熒光

神經(jīng)元內(nèi) Aβ42 在 AD 或 DS 切片中具有胞質(zhì)顆粒免疫反應(yīng)性^[8]，主要定位于神經(jīng)元的突觸前，尤其是突觸后隔室內(nèi)的多泡體中積累，但由于很快被大腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞清除，因此不容易觀察到。在唐氏綜合癥 (DS) 星形膠質(zhì)細(xì)胞中使用針對(duì) Aβ42 C 端產(chǎn)生的單克隆抗體進(jìn)行了免疫熒光顯微鏡觀察，顯示 DS 星形膠質(zhì)細(xì)胞中 Aβ42 呈囊泡狀分布 (圖 5a)^[9]。細(xì)胞內(nèi) Aβ42 能直接激活 p53 啟動(dòng)子，導(dǎo)致 p53 依賴性細(xì)胞凋亡。此外，氧化 DNA 損傷誘導(dǎo)了豚鼠原代神經(jīng)元中 Aβ42  的核定位和 p53 mRNA 升高。氧化 DNA 損傷可能誘導(dǎo) Aβ42 在胞質(zhì)溶膠中積累，然后依次在激活 p53 級(jí)聯(lián)反應(yīng)的細(xì)胞核中積累 (圖 5b) ^[10]。

圖 5. Aβ42 呈囊泡狀分布，且氧化 DNA 損傷誘導(dǎo)了 Aβ42 的核定位^[9][10]。
a. 正常 (NL) 和 DS 星形膠質(zhì)細(xì)胞中對(duì) Aβ42 進(jìn)行免疫熒光檢測(cè) (上)^[9]。b. H₂O₂ 誘導(dǎo)胚胎豚鼠腦細(xì)胞中 Aβ42 (綠色) 和 p53 (紅色) 的雙重免疫染色 (下)^[10]。

05
小貼士

IF 基本原理：根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團(tuán)，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原 (或抗體)。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及定量 (熒光面積或平均熒光強(qiáng)度等)。

Section.07
流式細(xì)胞術(shù)

Aβ 肽的異常神經(jīng)元積累會(huì)影響突觸傳遞并導(dǎo)致 AD 大腦的神經(jīng)退化。其中 Aβ40 和 Aβ42 能擾亂神經(jīng)元細(xì)胞的內(nèi)吞作用和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸。利用分析流式細(xì)胞術(shù)用 Aβ42 特異性抗體檢測(cè) AD 患者額葉皮層和紋狀體中發(fā)生的突觸變化，發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重 AD 患者大腦皮層中 Aβ42 陽(yáng)性突觸體的數(shù)量增加，并在人皮質(zhì)突觸體中積累 (圖 6a-c)^[11]。此外，Aβ40  通過(guò)減少 PC12 細(xì)胞對(duì) F-Aβ42 (熒光素標(biāo)記的 Aβ42) 的攝取來(lái)減少 Aβ42 在神經(jīng)元內(nèi)積累和溶酶體定位 (圖 6d-f)^[12]。

圖 6. AD 患者大腦皮層中 Aβ42 陽(yáng)性突觸體的數(shù)量增加^[11][12]。
(a-c) 用抗 Aβ42 抗體檢測(cè) AD 患者皮質(zhì)突觸體中 NFT 分布的 Braak 階段系統(tǒng)，神經(jīng)炎斑塊密度的 CERAD 評(píng)分和 Aβ42 斑塊分布的 Thal 期^[11]。（d）Aβ40 抑制分化的 PC12 細(xì)胞中對(duì) F-Aβ42 的攝取細(xì)胞內(nèi)熒光的流式細(xì)胞術(shù)直方圖顯示 Aβ40 預(yù)處理細(xì)胞中 F-Aβ42 攝取的抑制；（e）F-Aβ40 的攝取不受 Aβ42 預(yù)處理細(xì)胞的影響。（f）細(xì)胞內(nèi)熒光的幾何平均值^[12]。

06
小貼士

FC基本原理：利用激光激發(fā)帶有熒光標(biāo)記的微粒，檢測(cè)其散射光信號(hào)和熒光信號(hào)，從而反應(yīng)微粒的各個(gè)參數(shù)，并將特定性狀的微粒分選出來(lái)。

Section.08
表面等離子體共振

在正常生理?xiàng)l件下， Aβ42 和 Aβ40 肽以 1:9 的比例共存于大腦中。而在家族性 AD 患者的大腦中，該比率通常轉(zhuǎn)變?yōu)?Aβ42 的較高百分比，導(dǎo)致突觸毒性增加。據(jù)報(bào)道，盡管這兩種肽的化學(xué)性質(zhì)非常相似， Aβ42:Aβ40 比率的微小變化會(huì)極大地影響神經(jīng)毒性寡聚體的形成。利用 SPR 技術(shù)表征了不同生物素化的 Aβ42:Aβ40 比率的開始和結(jié)束狀態(tài)，并證實(shí)了 Aβ42 和 Aβ40 可以直接相互作用，并且它們相互影響各自的聚集行為 (圖 7)^[13]。

圖 7. Aβ42 和 Aβ40 直接相互作用^[13]。

07
小貼士

SPR 基本原理：指金屬表面的電子以及周圍介質(zhì)中的電子，以特殊頻率的共振而產(chǎn)生的一種特殊的電磁波，可以檢測(cè)抗原與抗體、DNA 與蛋白、蛋白與蛋白之間的相互作用。

 
參考文獻(xiàn)：
[1] Teunissen CE, et al. Plasma Amyloid-β (Aβ42) Correlates with Cerebrospinal Fluid Aβ42 in Alzheimer's Disease. J Alzheimers Dis. 2018;62(4):1857-1863.
[2] Bitan G, et al. Amyloid beta -protein (Abeta) assembly: Abeta 40 and Abeta 42 oligomerize through distinct pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Jan 7;100(1):330-5.
[3] Vosough F, et al. Characterization of Homogeneous and Heterogeneous Amyloid-β42 Oligomer Preparations with Biochemical Methods and Infrared Spectroscopy Reveals a Correlation between Infrared Spectrum and Oligomer Size. ACS Chem Neurosci. 2021 Feb 3;12(3):473-488.
[4] Pujol-Pina R, et al. SDS-PAGE analysis of Aβ oligomers is disserving research into Alzheimer´s disease: appealing for ESI-IM-MS. Sci Rep. 2015 Oct 9;5:14809.
[5] Gouras G K, et al. Intraneuronal Aβ42 accumulation in human brain[J]. The American journal of pathology, 2000, 156(1): 15-20.
[6] Murray MM, et al. Amyloid beta protein: Abeta40 inhibits Abeta42 oligomerization. J Am Chem Soc. 2009 May 13;131(18):6316-7.
[7] Weber DM, et al. High-Throughput Mass Spectrometry Assay for Quantifying β-Amyloid 40 and 42 in Cerebrospinal Fluid. Clin Chem. 2019 Dec;65(12):1572-1580.
[8] Takahashi RH, et al. Intraneuronal Alzheimer abeta42 accumulates in multivesicular bodies and is associated with synaptic pathology. Am J Pathol. 2002 Nov;161(5):1869-79.
[9] Busciglio J, et al. Altered metabolism of the amyloid beta precursor protein is associated with mitochondrial dysfunction in Down's syndrome. Neuron. 2002 Feb 28;33(5):677-88.
[10] Ohyagi Y, et al. Intracellular Abeta42 activates p53 promoter: a pathway to neurodegeneration in Alzheimer's disease. FASEB J. 2005 Feb;19(2):255-7.
[11] Postupna NO, et al. Flow cytometry analysis of synaptosomes from post-mortem human brain reveals changes specific to Lewy body and Alzheimer's disease. Lab Invest. 2014 Oct;94(10):1161-72.
[12] Omtri RS, et al. Differential Effects of Alzheimer's Disease Aβ40 and 42 on Endocytosis and Intraneuronal Trafficking. Neuroscience. 2018 Mar 1;373:159-168.
[13] Pauwels K, et al. Structural basis for increased toxicity of pathological aβ42:aβ40 ratios in Alzheimer disease. J Biol Chem. 2012 Feb 17;287(8):5650-60.