細(xì)胞生物學(xué)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)

基因轉(zhuǎn)染技術(shù)簡(jiǎn)介:轉(zhuǎn)染－即把核酸導(dǎo)入細(xì)胞，已經(jīng)成為當(dāng)前生命科學(xué)研究中基本操作之一，轉(zhuǎn)染方法有多種，包括介質(zhì)介導(dǎo)和電穿孔，其中介質(zhì)又有早期的磷酸鈣法，脂質(zhì)體法和病毒介導(dǎo)。目前使用最廣泛的是脂質(zhì)體介導(dǎo)法，有很多商品化轉(zhuǎn)染試劑可供選擇，很多公司，包括國內(nèi)研究人員耳熟能詳?shù)腎nvitrogen、Roche、Qiagen、Novagen等等都開發(fā)生產(chǎn)了轉(zhuǎn)染試劑，它們也的確幫助了多數(shù)研究者完成了轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵是高轉(zhuǎn)染效率和低細(xì)胞毒性，即把核酸轉(zhuǎn)入盡可能多的細(xì)胞，又要使轉(zhuǎn)染了核酸的細(xì)胞盡可能多地存活，且沒有發(fā)生分化。

脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染法:
脂質(zhì)體(lipofectin regeant,LR)試劑是陽離子脂質(zhì)體N-[1-2，3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1:1(w/w)]。它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前條件下最方便的轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5～100倍，能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞。用LR進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，首先需優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，應(yīng)找出該批LR對(duì)轉(zhuǎn)染某一特定細(xì)胞適合的用量、作用時(shí)間等，對(duì)每批LR都要做：第一，先要固定一個(gè)DNA的量和DNA/LR混合物與細(xì)胞相互作用的時(shí)間，DNA可從1～5μg和孵育時(shí)間6小時(shí)開始，按這兩個(gè)參數(shù)繪出相應(yīng)LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者最佳的劑量，確定出轉(zhuǎn)染時(shí)間(2～24小時(shí))。因LR對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，轉(zhuǎn)染時(shí)間以不超過24小時(shí)為宜。

細(xì)胞種類：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一種細(xì)胞均可作為受體細(xì)胞。
1、實(shí)驗(yàn)操作步驟[方法一]：
(1)：取6孔培養(yǎng)板(或用35mm培養(yǎng)皿)，向每孔中加入2mL含1～2×105個(gè)液，37℃CO2培養(yǎng)至40%～60%匯合時(shí)(匯合過分，轉(zhuǎn)染后不利篩選細(xì)胞)。
(2)轉(zhuǎn)染液制備：在聚苯乙稀管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染每一個(gè)孔細(xì)胞所用的量)A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋1-10μg DNA，終量100μL，B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋2-50μgLR，終量100μL,輕輕混合A、B液，室溫中置10-15分鐘，稍后會(huì)出現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉(zhuǎn)染(如出現(xiàn)沉淀可能因LR或DNA濃度過高所致，應(yīng)酌情減量)。
(3)轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備：用2mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入1mL不含血清培養(yǎng)液。
(4)轉(zhuǎn)染：把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，37℃溫箱置6～24小時(shí)，吸除無血清轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
(5)其余處理如觀察、篩選、檢測(cè)等與其它轉(zhuǎn)染法相同。
注意：轉(zhuǎn)染時(shí)切勿加血清，血清對(duì)轉(zhuǎn)染效率有很大影響。

2、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟如下[方法二]：
(1)以5×105細(xì)胞/孔接種6孔板(或35mm培養(yǎng)皿)培養(yǎng)24小時(shí)，使其達(dá)到50～60%板底面積。
(2)在試管中配制DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物方法如下：
①在1mL無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質(zhì)粒DNA或供體DNA。
②旋轉(zhuǎn)1秒鐘，再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉(zhuǎn)。
③室溫下放置5～10分鐘，使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上。
(3)棄去細(xì)胞中的舊液，用1mL無血清DMEM洗細(xì)胞一次后棄去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，37℃培養(yǎng)3～5小時(shí)。
(4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)14～24小時(shí)，
(5)吸出DMEM/DNA/脂質(zhì)體混合物加入新鮮10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培養(yǎng)24～48小時(shí)。
(6)用細(xì)胞刮或消化法收集細(xì)胞，以備分析鑒定。

穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法如下：
(1)接種細(xì)胞同前，細(xì)胞長(zhǎng)至50%板底面積可用于轉(zhuǎn)染。
(2)DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前(2)、(3)步驟。
(3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37℃培養(yǎng)48小時(shí)。
(4)吸出DMEM，用G418選擇培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞生長(zhǎng)一定時(shí)間，篩選轉(zhuǎn)染克隆，方法參照細(xì)胞篩選法進(jìn)行。

影響轉(zhuǎn)染的因素：
轉(zhuǎn)染是否成功的影響因素很多，如需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型（對(duì)于困難的細(xì)胞系尤其如此），需要被轉(zhuǎn)染的分子（DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白質(zhì)），轉(zhuǎn)染試劑等。但無論在何種情況下，轉(zhuǎn)染的成功均取決于轉(zhuǎn)染效率、低細(xì)胞毒性以及重現(xiàn)性這幾個(gè)要素。

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