基因敲除小鼠在藥物依賴性研究中的應用

基因敲除(gene knockout ) 是 80年代初出現(xiàn)的一項新的基因工程技術, 是制備轉基因動物的重要技術之一。利用該技術可以培育先天缺陷某一特定基因的動物, 以此研究該特定基因的生理功能或在疾病發(fā)生發(fā)展中的意義。近年來基因敲除小鼠在藥物依賴性研究中也得到廣泛的應用。在傳統(tǒng)的藥物依賴性研究中, 往往選取特異性的受體配體來研究該受體在依賴性中的作用, 但這種特異性往往是相對的 ,劑量改變就可能影響其它受體的功能,所以難以真正確定該受體的作用。而基因敲除技術在這方面具有獨特的優(yōu)點, 因為利用基因敲除技術可以選擇性敲除某一特定受體基因, 獲得先天缺陷該受體基因的小鼠,通過比較基因缺失動物(本文簡稱 KO型) 和野生型動物(本文簡稱 WT 型) 在依賴性模型上的行為差別 , 可以準確判斷該受體所發(fā)揮的作用�？梢哉f, 基因敲除技術的發(fā)展為藥物依賴性研究帶來了一場新的革命。本文綜述了近年來這一方面的研究進展。

1 基因敲除技術簡介[1 ]

基因敲除是通過人為干預達到抑制或滅活目的基因表達的分子生物學技術。它采用同源重組方法(homologous recombinat ion)用突變的基因刪除(取代)相應的正�；�因, 或用正常基因敲除相應的突變基因, 從表達水平或轉基因動物的表現(xiàn)型來研究正�；�因的功能和突變部位的作用。利用基因打靶 (gene target ing) 技術獲得基因敲除動物是其中的一種方法, 其步驟是使胚胎干細胞內的目的基因進行定點突變 (基因打靶) , 將打靶后已定點突變的胚胎干細胞注射到宿主胚泡中, 再將胚胎植入假孕母體的子宮內,使其發(fā)育成目的基因缺陷 (突變) 的雜合的種系嵌合體, 將其自交后再篩選出目的基因缺陷型的純合子即基因敲除動物。通過分析基因敲除動物體內單基因缺陷所產生的表型異常來研究基因調控和功能, 建立疾病的動物模型以及進行基因治療等。

2 敲除阿片受體基因

阿片受體是阿片類物質直接作用的受體, 不僅在介導阿片類鎮(zhèn)痛中發(fā)揮重要作用, 而且也與精神活藥物物的依賴性有關。阿片受體分為μ、δ和κ等幾種亞型,目前 ,已經培育了μ、κ和δ受體缺陷的小鼠 ,為研究μ、κ和δ受體在藥物依賴性中的作用提供了很好的實驗模型。

2. 1μ阿片受體

μ受體基因敲除小鼠, 其后代符合孟德爾遺傳規(guī)律, 28. 6 %野生型, 46. 6 %雜合子, 24. 8 %的純合子 , 說明突變的μ受體基因缺陷小鼠沒有發(fā)生宮內和出生后死亡。這種小鼠的生長、發(fā)育、生殖和活動周期等與正常小鼠無明顯差異。放射配體結合實驗顯示 ,μ受體 KO 小鼠沒有任何μ受體存在,但δ和κ受體的數(shù)量和分布未受影響[2 ]。

藥物是選擇性較高的μ阿片受體激動劑, 其對WT小鼠有很強的鎮(zhèn)痛作用, 但在μ受體 KO小鼠不出現(xiàn)鎮(zhèn)痛。在浸尾、甩尾和熱板法鎮(zhèn)痛試驗中,對μ受體KO小鼠皮下注射藥物達到 50 mg·kg- 1,鞘內或腦室內注射藥物劑量達到WT小鼠鎮(zhèn)痛ED50的15倍都不產生鎮(zhèn)痛作用。表明μ阿片受體基因編碼的受體對介導藥物在痛通路中的作用是必須的。在同樣實驗條件下,藥物在κ、δ受體KO小鼠仍有鎮(zhèn)痛作用, 證明了κ和δ受體不參與介導藥物鎮(zhèn)痛。用條件性位置偏愛方法評價藥物的欣快效應證明藥物(3 mg·kg- 1sc)在 WT 小鼠產生 CPP 效應 ,而在μ受體 KO 小鼠不能引起 CPP 效應。慢藥物物給藥使 WT 小鼠形成身體依賴性, 納洛酮誘發(fā)其出現(xiàn)戒斷癥狀, 同樣處理μ受體 KO 小鼠不出現(xiàn)戒斷癥狀。重復藥物給藥使 WT 小鼠腦內腺苷酸環(huán)化酶的活性上調, 而在μ受體 KO 小鼠腦不產生腺苷環(huán)化酶活性上調 [3 ], 說明藥物產生的精神依賴性和身體依賴性是μ阿片受體介導的, μ阿片受體基因編碼的產物是藥物藥理效應的既定的分子靶位。

2. 2κ阿片受體

κ受體 KO 小鼠的自發(fā)活動與 WT 小鼠無差別。κ受體激動劑 U50488H 在κ受體 KO 小鼠不引起鎮(zhèn)痛作用 , 也不形成條件性位置厭惡效應, 而在WT 小鼠出現(xiàn),表明κ受體在κ激動劑作用中的重要性。藥物在κ受體 KO 小鼠的鎮(zhèn)痛作用和條件性位置偏愛效應與 WT 小鼠無差別, 但藥物的戒斷癥狀則明顯弱于 WT 小鼠, 說明κ受體不參與藥物的鎮(zhèn)痛和獎賞效應, 但參與調節(jié)藥物的身體依賴性[4 ]。

2. 3δ阿片受體

在δ阿片受體基因敲除小鼠,δ受體激動劑DPDPE 的鎮(zhèn)痛作用在脊髓水平明顯減弱, 但在脊髓上水平的鎮(zhèn)痛作用與野生型無差異, 說明δ受體在不同部位的鎮(zhèn)痛效應中所起的作用不一樣。實驗還發(fā)現(xiàn)δ受體敲除小鼠不對藥物的鎮(zhèn)痛作用產生耐受性 [5 ], 但δ受體敲除小鼠在依賴性中的作用還有待于進一步研究。

3 敲除多巴胺受體或多巴胺遞質轉運體基因

多巴胺 (DA) 系統(tǒng)是藥物精神依賴性的神經基礎, 中腦邊緣DA 系統(tǒng)是“獎賞系統(tǒng)”中最重要的一環(huán)。DA 受體亞型有兩類: D1 樣 (D1 和D5 受體) 和D2樣(D2、 D3 和D4 受體) ,不同的DA 受體亞型在藥物獎賞中發(fā)揮的作用也不相同。利用基因敲除技術已經培育出了D1、 D2、 D3、 D4 受體缺陷的實驗小鼠,為探討DA 受體在藥物獎賞效應中的作用提供了依據。

3. 1 D1 受體

D1 受體 KO 小鼠基礎性活動多于 WT 小鼠。可卡因能使 WT 小鼠活動增加,而不能使D1 受體 KO小鼠活動增加, 但可卡因的位置偏愛效應在兩種小鼠都出現(xiàn)[6 ]。苯丙胺反復給藥的行為敏化現(xiàn)象在D1 受體 KO 小鼠低于 WT 小鼠; 苯丙胺在D1受體KO小鼠和WT小鼠都形成自身給藥, 但 KO 小鼠的陽性反應率低于 WT 小鼠[7 ]。這些實驗說明D1 受體激活可能是可卡因、苯丙胺運動增強效應所必需的,而不是獎賞效應所必需的。但這與正常 WT 型的實驗結果不一致, 因為在正常鼠, D1 受體拮抗劑可抑制藥物的自身給藥和偏愛效應。造成這種不一致的原因可能與受體拮抗劑的特異性有關, 也可能與基因敲除小鼠的遺傳異常有關。

3. 2 D2 受體

在阿片類誘導的運動增強效應實驗中, D2 受體KO 小鼠對內源性和外源性阿片類物質誘導的運動增強效應與 WT 小鼠無顯著性差異, 表明 D2 受體缺失未影響阿片誘導的運動增強效應。在藥物身體依賴性實驗中,D2 受體 KO 小鼠和 WT 小鼠的戒斷癥狀沒有明顯差別,說明 D2 受體在阿片身體依賴性中不起重要作用。在位置偏愛實驗中, D2 受體 KO小鼠不對藥物形成偏愛效應, 但對食物形成偏愛效應 ,說明 D2 受體在精神依賴性中起重要作用; 并且藥物獎賞和自然獎賞效應的機制可能不同[8 ]。

3. 3 D3 受體

與WT小鼠相比,D3受體KO小鼠的基礎活動增加 ,低劑量的可卡因可D3受體KO小鼠活動增加 ,但在高劑量下與 WT 型無差別。D3受體KO小鼠對苯丙胺的偏愛效應更敏感, 因為很小劑量的苯丙胺就能使其形成位置偏愛。Xu[9 ]認為正常情況下D3受體可能起著對抗D1和D2受體的作用,在D3受體KO小鼠 ,這種 D3 受體的對抗作用沒有了,使苯丙胺的作用更加明顯,較小劑量就能發(fā)揮效應。

3. 4 D4 受體

D4 受體 KO小鼠基礎活動降低, 對D4受體激動劑氯氮平的敏感性也降低,但乙醇、可卡因、藥物基苯丙胺使D4受體KO小鼠活動增多[10 ],其機制還不清楚。關于D4受體KO小鼠的依賴性特性還缺乏研究資料。

3. 5 DA 轉運體

DA 轉運體(dopamine t ransporter , DAT)位于突觸前膜,重攝取突觸間隙中的DA進入神經末梢,是終止DA生理效應的主要方式。DAT KO小鼠體重增長緩慢,成熟之前易死亡,但生殖能力旺盛,母鼠分娩后缺乏哺乳行為。該自發(fā)活動明顯增加, 但對可卡因和苯丙胺的運動增強或刻板活動特性反應減弱 , 說明 DAT 是可卡因和苯丙胺的作用靶位點。在依賴性實驗中,可卡因使 WT 型和 DAT KO小鼠都形成靜脈自身給藥和偏愛效應[11 ],藥物同樣可使 KO 型形成偏愛效應[12 ]。與之相矛盾的是,在正常鼠 ,DAT 阻滯劑可以抑制可卡因的自身給藥。

3. 6 囊泡單胺轉運體

囊泡單胺轉運體 (vesicular monoamine t rans2porter , VMAT) 的作用是將單胺類從細胞漿轉運至囊泡儲存,分為1型和2型, VMAT2 主要分布于神經末梢,對DA、組胺、5 - HT 等單胺類特異性較高。Wang 等[13 ]培育了VMAT2基因缺陷小鼠, 發(fā)現(xiàn)該小鼠成活率低, 出生后幾天內即死亡, 以后的實驗只能用雜合子和 WT 型進行。在雜合子小鼠,紋狀體 DA 濃度很低, K+和苯丙胺誘發(fā)的DA 釋放作用也降低, 說明在雜合子 VMAT2 的功能也受到影響。實驗發(fā)現(xiàn),雜合子小鼠對可卡因、苯丙胺和乙醇的運動增強效應比 WT 型更敏感; 苯丙胺誘發(fā)WT 型產生偏愛效應, 而不誘發(fā)雜合子產生偏愛效應[14 ]。這些結果反映 VMAT2 參與維持藥物的獎賞效應。4 敲除 5 - HT受體和 5 - HT轉運體基因研究表明 5 - 羥色胺(5 - HT) 系統(tǒng)參與調節(jié)藥物的獎賞效應, 但目前只培育了 5 - HT1B 受體 KO小鼠和 5 - HT 轉運體 KO 小鼠。

4. 1 5 - HT1B 受體

在 5 - HT1B受體KO小鼠,可卡因累進比率自身給藥實驗中的“終點”(break point )明顯高于WT小鼠,對食物形成的強化效應在兩種小鼠相同,表明5 - HT1B 受體KO小鼠對可卡因更易形成自身給藥。

在 5 - HT1B 受體KO小鼠,可卡因誘發(fā)的自發(fā)活動和刻板運動強于WT型; 慢性給可卡因, WT的刻板運動逐日增加, 而5- HT1B受體KO小鼠從d2起不再增加; 由此可見, 5 - HT1B 受體KO小鼠對可卡因引發(fā)的自發(fā)活動增強更敏感, 而WT小鼠對可卡因的刻板運動更敏感。一般認為, 黑質紋狀體DA 系統(tǒng)與刻板運動有關, 中腦邊緣DA系統(tǒng)與自發(fā)活動和獎賞效應有關。因此, 以上實驗說明在5 - HT1B 受體 KO 小鼠 , 中腦邊緣 DA 系統(tǒng)的活動更為突出。免疫組化實驗顯示,KO 型小鼠伏隔核的△FosB 等 Fos 相關抗原表達增強,這種增強在 WT小鼠慢性給可卡因時出現(xiàn), 說明5 - HT1B受體 KO小鼠遺傳上的特點與 WT 小鼠慢性給可卡因出現(xiàn)的變化相似。因此, 興奮劑對5 - HT1B 受體KO小鼠更易產生獎賞效應[15 ]。但最近卻發(fā)現(xiàn)相反的結果,可卡因不能使 5 - HT1B 受體 KO 小鼠形成位置偏愛效應[16 ]。結果不一致的原因有待于進一步研究。4. 2 5 - HT 轉運體5 - HT轉運體(serotonin t ransporter ,5 - HTT)位于 5 - HT 神經元的突觸前膜,重攝取突觸間隙中的 5 - HT 進入神經末梢。在5 - HTT KO 小鼠模型上 , 可卡因仍能形成偏愛效應, 說明 5 - HTT 的缺失不影響可卡因的獎賞效應[11 ]。

5 敲除 CB1 受體基因

大麻受體分為CB1和CB2型受體 , CB1型受體主要分布于神經系統(tǒng) ,與大麻的精神作用有關。Ledent等[17 ]培育了CB1受體KO小鼠。對WT型及CB1受體KO小鼠都給予△9- THC , 發(fā)現(xiàn)其鎮(zhèn)痛、活動減少、體溫降低、血壓下降、戒斷反應及自身給藥等作用在 WT 小鼠出現(xiàn),而在 CB1 受體 KO 小鼠不出現(xiàn) , 說明大麻類的主要藥理學特性是由CB1受體介導的。

若將兩種鼠都用阿片類處理, 發(fā)現(xiàn)藥物急性給藥的鎮(zhèn)痛、降溫作用和多次給藥的鎮(zhèn)痛耐受現(xiàn)象,以及 U50488H 的鎮(zhèn)痛和活動減少效應在兩種鼠沒有差別。但與 WT 型相比 ,CB1 受體 KO 小鼠的藥物戒斷癥狀明顯減輕,藥物自身給藥現(xiàn)象明顯減弱,也不對 U50488H 形成條件性位置厭惡效應, 說明阿片類的身體依賴性和精神依賴性都與CB1 受體有關。另有實驗發(fā)現(xiàn), 在 CB1 受體 KO 小鼠 , 藥物不能引起伏隔核DA 釋放[18 ],說明 CB1 在藥物促伏隔核DA釋放中發(fā)揮一定作用。

6 敲除一氧化氮合酶基因

在神經系統(tǒng),一氧化氮(NO)可作為一種信息傳遞物質參與腦內多種生理功能。近年來證明,NO 參與藥物耐受和依賴, NO合酶(NOS)抑制劑可減輕阿片的戒斷癥狀。而敲除 NOS 基因的小鼠對可卡因的運動增強和行為敏化反應減弱, 對可卡因也不形成位置偏愛[19],進一步驗證了NO在藥物獎賞效應中的作用。

7 其它

不同實驗室還培育了許多敲除其它基因的轉基因動物 , 其中有些做過與藥物依賴性有關的實驗。如: 可卡因急性給藥可誘導正常鼠前皮質組織纖溶酶原激活因子 (t issue plasminogen act ivator, t PA)表達, 在KO小鼠 ,可卡因的活動增強和行為敏化效應比WT型強; KO和WT 型都能形成可卡因的自身給藥, 但形成自身給藥后如果只給信號刺激不給可卡因, WT型壓桿率降低 , 而KO型壓桿率不降低,說明tPA在依賴性中可能發(fā)揮比較特殊的作用[20 ]。再如:尼古丁可刺激WT小鼠紋狀體釋放DA ,而在敲除N型膽堿受體β2亞單位的小鼠,尼古丁就沒有這種作用。說明N受體參與尼古丁的精神依賴性[21]。最近發(fā)現(xiàn)敲除P物質受體,藥物的戒斷癥狀和獎賞效應都減弱[22 ]。

8 結語

利用基因敲除技術選擇性敲除某特定基因, 為研究該特定基因在依賴性中作用提供了直接依據。利用該模型研究各種遞質受體、轉運體以及各種代謝酶在依賴性中的作用已經取得了一定進展。這種實驗方法特異性高, 避免了受體拮抗劑特異性低的缺點 ,可以“真實”地體現(xiàn)目的基因的活動特性。但任何事物都有兩重性,有優(yōu)點 ,也有缺點。轉基因動物通過基因改造造成了動物先天的遺傳異常, 生長發(fā)育過程中可能會發(fā)生一些意想不到的變化, 況且一種基因敲除了,其它基因功能可能代償性增強,這就為解釋實驗結果增加了困難, 這也可能是在有些轉基因動物上取得的結果與在正常動物上用特異性拮抗劑取得的結果不一致的原因之一。目前正在發(fā)展中的條件性基因敲除技術可以在成年鼠使某一基因突變 , 從而避免了發(fā)育過程中的遺傳缺陷。相信在不久的將來,隨著各種技術的成熟,利用轉基因動物研究藥物依賴性的機制乃至篩選治療藥物都將得到進一步發(fā)展 。