新冠小鼠模型在抗疫中的技術(shù)運用

全球新冠疫苗的研發(fā)，目前已經(jīng)取得了很大進展，多種技術(shù)方式制備的疫苗已經(jīng)進入臨床II期。然而動物模型的相對短缺，很大程度影響了現(xiàn)階段新冠疫苗的研發(fā)及臨床試驗的進程，我們需要更多地了解動物模型的選擇、制備以及應用等多方面的信息，來完善疫苗或抗病毒藥物的研發(fā)和生產(chǎn)步驟，為人類的生命安全和生存質(zhì)量提供保障。

 

SARS研究中的小鼠模型回顧

歷史總是驚人的相似，從SARS到MERS，所用到的動物模型對我們現(xiàn)在選擇新冠病毒動物模型都有著重要的借鑒意義。2016年美國國立衛(wèi)生研究院傳染病實驗室Troy C Sutton和Kanta Subbarao教授發(fā)表綜述性文章，詳細論述了在研究冠狀病毒的過程中動物模型的發(fā)展和應用。從小鼠模型來看，研究者用BALB/c近交系小鼠從鼻腔滴入SARS-CoV進行攻毒實驗，但是結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠沒有出現(xiàn)體重減輕、肺部病理等臨床現(xiàn)象。用C57BL/6小鼠獲得了相似的結(jié)果，仍然缺乏臨床表型。在B6以及129SvEv背景條件下，缺乏NK細胞功能或者NK-T細胞的CD1-/-小鼠，和缺乏T和B淋巴細胞的RAG1-/-小鼠的病毒復制動力學相似，且均未出現(xiàn)臨床疾病表型。B6背景的STAT1-/-小鼠在組織病理學檢查中顯示有自限性毛細支氣管炎和片狀間質(zhì)性肺炎。但是，在129SvEv背景的STAT1-/-小鼠中，表現(xiàn)出進行性體重減輕和細支氣管炎，并發(fā)展為間質(zhì)性肺炎和縱隔炎。盡管小鼠顯示出感染和肺部疾病的跡象，但近交系小鼠未能準確地再現(xiàn)在人類觀察到的彌漫性肺泡損傷、水腫、肺細胞壞死和透明膜形成。

 

為了模擬流行病學發(fā)現(xiàn)的高齡所導致的死亡率增加現(xiàn)象，研究者開發(fā)了SARS-CoV的老年小鼠模型。在此模型中，BALB/c和B6小鼠在肺中表現(xiàn)出高水平的病毒復制，并且這兩種小鼠的體重均有減輕，成年BALB/c小鼠還表現(xiàn)出皮毛褶皺和脫水。所有試驗觀察到，老年小鼠模型對病毒的反應更接近人類所表現(xiàn)出的病毒感染表型，因此老年小鼠比年輕小鼠得到了更廣泛的應用。

 

圖1. 轉(zhuǎn)基因ACE2小鼠模型構(gòu)建方案1

（參考文獻：Paul B. McCray, Jr. et al. 2007）

 

為建立SARS-CoV感染的致死小鼠模型，研究者們研發(fā)了表達人ACE2（hACE2）的轉(zhuǎn)基因小鼠。通常，轉(zhuǎn)基因小鼠的疾病嚴重程度與hACE2表達水平相關(guān)。在細胞角蛋白啟動子控制下表達hACE2的轉(zhuǎn)基因小鼠在肺、肝、結(jié)腸和腎臟中具有高水平的ACE2 mRNA。當這些小鼠接觸到SARS-CoV，從氣道上皮開始感染，逐漸擴散到大腦，到第7天時死亡率達到100％。

 

圖2. 轉(zhuǎn)基因ACE2小鼠模型構(gòu)建方案2

（參考文獻：Chien-Te K. Tseng et al. 2007）

 

另一種hACE2模型，是在巨細胞病毒IE增強子的雞β-肌動蛋白啟動子控制下表達hACE2，產(chǎn)生了具有不同水平的hACE2的轉(zhuǎn)基因小鼠品系。用SARS-CoV感染hACE2高表達的小鼠產(chǎn)生了嚴重的肺部和腦部感染，死亡率為100％。這類小鼠表現(xiàn)出嚴重的間質(zhì)性肺炎，伴有肺外器官損害，因此可以相對準確地模擬人類SARS-CoV感染的病理狀態(tài)。

 

以上研究表明，在小鼠ACE2啟動子的控制下表達hACE2，可導致hACE2的組織分布受到限制。受到SARS-CoV攻擊的hACE2低表達的小鼠變得昏昏欲睡，但不會出現(xiàn)嚴重感染致死。研究還發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因小鼠的腦組織中觀察到病毒載量或病毒抗原有所增加，并且由于病毒在腦中的廣泛傳播導致死亡率增加，而人類臨床很少觀察到中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。因此，雖然轉(zhuǎn)基因小鼠提供了SARS-CoV感染的致死模型，但沒有小鼠模型能夠全面精確地復制SARS-CoV感染患者被病毒感染的整個進程。

 

在不斷探索和驗證SARS-CoV小鼠模型的過程中，我們發(fā)現(xiàn)基因編輯技術(shù)是小鼠模型發(fā)展的一個重要限制因素。隨著CRISPR/Cas9的發(fā)現(xiàn)和普及，人源化小鼠模型應運而生。這種模型可以實現(xiàn)基因在特定時間和位點的插入及表達，更精準地模擬人類感染疾病的狀態(tài)，更清晰地認識病毒與人類相互作用的方式和過程，這樣我們就能夠制備更合理的方案來應對各種并不友善的“天外來賓”。

 

新冠病毒就是這樣一個不速之客，它與SARS-CoV有著非常相似的地方，因此以上小鼠模型對于研究新冠病毒具有非常重要的借鑒意義�？蒲腥藛T在這些研究的基礎(chǔ)上運用新技術(shù)對模型進行更新和完善，構(gòu)建了不同類型的新冠小鼠模型。那么，這些新冠小鼠模型是如何構(gòu)建的呢？是否能準確全面地模擬人體感染病毒的過程呢？

 

多種新冠小鼠模型的比較分析

新冠小鼠模型研發(fā)的基礎(chǔ)是基因編輯技術(shù)。所以我們需要進一步探討，在目前基因編輯技術(shù)下所誕生的新冠小鼠模型是怎樣制備的？它們的應用價值到底體現(xiàn)在哪里？

 

2020年6月5日，軍事醫(yī)學科學院北京微生物與流行病學研究所病原與生物安全國家重點實驗室在《Cell Host & Microbe》發(fā)表了題為“A mouse model of SARS-CoV-2 infection and pathogenesis”的論文，該研究建立了一種新的hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠模型，通過新冠病毒攻毒實驗，成功模擬了病毒在人體內(nèi)的發(fā)病過程、病理特征和傳播方式。

 

圖3. hACE2人源化小鼠的構(gòu)建方案

（參考文獻：Shi-Hui Sun et al. 2020）

 

如上圖所示，打靶策略是將hACE2完整的cDNA插入位于X染色體GRCm38.p6位點的mACE2基因第二個外顯子處，這樣就破壞并終止了mACE2的表達。將tdTomato基因插入帶有內(nèi)部核糖體進入位點（IRES）的hACE2下游，從而使hACE2和tdTomato共表達。添加了土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件（WPRE）和polyA序列，以增強mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。該靶向策略允許hACE2的表達在mACE2啟動子的調(diào)控下進行。將靶向構(gòu)建體連同亞基因組RNA（sgRNA）和Cas9 mRNA一起注入C57BL/6小鼠的受精卵中。

 

該小鼠模型采用CRISPR/Cas9敲入技術(shù)制備，將內(nèi)源性小鼠ACE2（mACE2）替換為人類ACE2（hACE2），與野生型C57BL/6小鼠相比，年輕和年老的hACE2小鼠在鼻內(nèi)感染后均在肺、氣管和腦中維持高病毒載量。盡管未觀察到死亡，但在新冠病毒感染的hACE2小鼠中發(fā)現(xiàn)了間質(zhì)性肺炎和細胞因子升高。有趣的是，該研究還發(fā)現(xiàn)，新冠病毒在hACE2小鼠胃內(nèi)接種也會引起感染并導致肺部病理改變，這為新冠病毒的感染和傳播提供了一個新的思路。

 

圖4. C57BL/6和BALB/c制備ACE2的腺病毒轉(zhuǎn)導新冠小鼠模型

（參考文獻：Jing Sun et al. 2020）

 

制備新冠小鼠模型除了轉(zhuǎn)基因的方式之外，還有用腺病毒載體轉(zhuǎn)導hACE2制備新冠模型小鼠的方法。2020年6月10日，廣州呼吸疾病國家重點實驗室趙金存教授團隊聯(lián)合多家單位共同發(fā)表了利用腺病毒載體制備的新冠小鼠模型，如圖4所示，該研究通過復制缺陷型腺病毒（Ad5-hACE2）將外源hACE2通過鼻內(nèi)轉(zhuǎn)導的方式遞送入C57BL/6和BALB/c兩種品系及相應基因敲除的小鼠中，對小鼠進行攻毒實驗，通過免疫印跡和流式細胞術(shù)檢測hACE2的表達。

 

研究觀察到hACE2主要在肺泡上皮中表達，偶爾在氣道上皮中有陽性細胞。感染新冠病毒的Ad5-hACE2轉(zhuǎn)導的BALB/c小鼠以及C57BL/6在感染2天后開始出現(xiàn)皮毛起皺、駝背和呼吸困難等癥狀，類似于SARS-CoV感染BALB/c小鼠。兩種小鼠品系的肺組織均顯示出多種損傷，包括血管周圍至間質(zhì)性炎性細胞浸潤、壞死細胞碎片和肺泡水腫。這些都表明，該方法制備的新冠小鼠模型對新冠病毒易感，能夠有效評估疫苗和藥物的療效。

 

圖5. 利用AdV-hACE2轉(zhuǎn)導的新冠小鼠模型制備中和抗體

（參考文獻：Ahmed O. Hassan et al. 2020）

 

華盛頓大學醫(yī)學部研究團隊用同樣的方法，利用AdV-hACE2鼻內(nèi)和靜脈轉(zhuǎn)導BALB/c小鼠制備新冠小鼠模型，結(jié)果表明，hACE2的腺病毒轉(zhuǎn)導使SARS-CoV-2感染BALB/c小鼠，并且能產(chǎn)生高效中和抗體。

 

賽業(yè)生物作為模式動物領(lǐng)域發(fā)展的領(lǐng)先者，在新冠疫情爆發(fā)初期，便組織研發(fā)團隊全力開發(fā)新冠小鼠模型。我們利用自主研發(fā)的TurboKnockout技術(shù)和經(jīng)過優(yōu)化的CRISPR-Pro技術(shù)同步開展BALB/c、C57BL/6J、C57BL/6N三種背景品系的人源化小鼠制備，并綜合考慮不同基因編輯方式的優(yōu)缺點，設計了多種基因打靶方案，以滿足不同研究目的和不同應用方向的需求。

 

新冠疫情發(fā)生到現(xiàn)在已經(jīng)有半年時間，而疫苗和抗病毒藥物的研發(fā)逐漸明朗，雖然不能馬上用于感染者進行預防和治療，但抗疫取得了階段性的勝利是有目共睹的。在這個過程中，小鼠成了人類抗疫路上的偉大助手，實現(xiàn)了它對人類的最大價值。人類共同命運，生物和諧生存，愿我們擁有一個更美好的地球家園。

 

參考文獻：

1、Troy C Sutton and Kanta Subbarao. Development of Animal Models Against Emerging Coronaviruses: From SARS to MERS coronavirus. Virology. 2015

2、Paul B. McCray, Jr., Lecia Pewe, Christine Wohlford-Lenane et al. Lethal Infection of K18-hACE2 Mice Infected with Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus. Journal of virology. 2007

3、Tseng CT, Huang C, Newman P et al. Severe acute respiratory syndrome coronavirus infection of mice transgenic for the human Angiotensin-converting enzyme 2 virus receptor. Journal of virology. 2007

4、Chien-Te K. Tseng, Cheng Huang, Patrick Newman et al. Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Infection of Mice Transgenic for the Human Angiotensin-Converting Enzyme 2 Virus Receptor. Journal of virology. 2007

5、Shi-Hui Sun, Qi Chen, Hong-Jing Gu et al. A Mouse Model of SARS-CoV-2 Infection and Pathogenesis. Cell Host & Microbe. 2020

6、Jing Sun, Zhen Zhuang, Jian Zheng et al. Generation of a Broadly Useful Model for COVID-19 Pathogenesis Vaccination, and Treatment. Cell. 2020

7、Roberts, A., Deming, D., Paddock, C.D. et al. A mouse-adapted SARS-coronavirus causes disease and mortality in BALB/c mice. PLoS Pathog. 2007

8、Ahmed O. Hassan, James Brett Case, Emma S. Winkler et al. A SARS-CoV-2 infection model in mice demonstrates protection by neutralizing antibodies. Cell. 2020