云序超微量MeRIP測(cè)序技術(shù)在m6A甲基化文章發(fā)表的應(yīng)用

​m6A甲基化是近年來(lái)一大熱門(mén)研究方向，種種研究表明m6A修飾在各種真核生物、各類組織細(xì)胞中普遍存在，并對(duì)多種生物學(xué)功能、疾病腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有極大影響。m6A甲基化位點(diǎn)的檢測(cè)依賴于MeRIP-seq，其中的抗體免疫共沉淀（IP）環(huán)節(jié)要求樣品RNA起始量相較普通轉(zhuǎn)錄組測(cè)序要高，曾經(jīng)令許多難以大量獲取的組織、細(xì)胞或體液樣本被拒在m6A研究的大門(mén)之外。

云序生物自2018年推出了超微量RNA甲基化測(cè)序（超微量MeRIP-seq），對(duì)免疫共沉淀和高通量測(cè)序步驟進(jìn)行優(yōu)化，克服了常規(guī)抗體富集至少需要100μg總RNA的難題，實(shí)現(xiàn)了僅需500ng總RNA即可IP、建庫(kù)測(cè)序，為微量樣本研究m6A等甲基化修飾帶來(lái)福音。本期我們就為大家解析兩篇云序客戶近期發(fā)表的應(yīng)用了超微量merip技術(shù)測(cè)序的m6A表達(dá)譜文章。

文章1：高度近視眼晶狀體前囊膜的m6A修飾譜
發(fā)表日期：2020.10.27

研究單位：天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院孫靖教授團(tuán)隊(duì)

影響因子：4.251

研究方法：m6A-MeRIP-seq，RNA-seq

樣品類型：?jiǎn)渭儼變?nèi)障患者和高度近視的白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜

樣本數(shù)量：3 ：3

RNA量：低至500ng

文章鏈接：Comprehensive analysis of transcriptome-wide m6A methylome in the anterior capsule of the lens of high myopia patients
文章解析：
1）m6A位點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)和分布

文章通過(guò)m6A-MeRIP-seq，在單純白內(nèi)障患者和高度近視的白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜中分別檢測(cè)到13617和8569個(gè)m6A位點(diǎn)，發(fā)生m6A修飾的基因分別為8196和5896個(gè)。文章展示了兩組中m6A位點(diǎn)的分布和motif序列，并對(duì)具有單個(gè)和多個(gè)m6A位點(diǎn)的基因進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。
2）m6A修飾基因的功能

為了探究m6A修飾與高度近視的關(guān)系，文章對(duì)兩組間差異基因進(jìn)行了GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)m6A修飾差異基因多與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化和形成有關(guān)。
3) m6A修飾與基因表達(dá)聯(lián)合分析

通過(guò)m6A-MeRIP-seq和RNA-seq聯(lián)合分析，文章展示了m6A修飾水平與基因表達(dá)水平間的關(guān)系，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)表達(dá)高的基因分組中，受m6A修飾的基因比例也更高。
4）甲基化相關(guān)酶的表達(dá)

通過(guò)qPCR檢測(cè)了兩組樣品中6個(gè)甲基化相關(guān)酶的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在高度近視白內(nèi)障患者中甲基化酶METTL3表達(dá)上升，去甲基化酶FTO和 ALKBH5、識(shí)別蛋白YTHDF1和YTHDF2表達(dá)下降，暗示這些酶可能通過(guò)調(diào)節(jié)m6A修飾在高度近視中發(fā)揮影響。 
文章2：老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)circRNA的m6A修飾和甲基化酶
發(fā)表日期：2020.8.6

研究單位：南通大學(xué)附屬醫(yī)院眼科研究所

研究方法：m6A-MeRIP-seq，RNA-seq

樣品類型：老年白內(nèi)障患者（ARC）和正常人的晶狀體上皮細(xì)胞

樣本數(shù)目：3:3

RNA量：低至500ng

文章鏈接：Identification and Characterization of N6 -Methyladenosine CircRNAs and Methyltransferases in the Lens Epithelium Cells From Age-Related Cataract

文章解析：

1）circRNA甲基化位點(diǎn)和表達(dá)水平整體統(tǒng)計(jì)

文章通過(guò)對(duì)老年白內(nèi)障患者和正常人的晶狀體上皮細(xì)胞進(jìn)行m6A-MeRIP-seq, 檢測(cè)到circRNA中患者特有的m6A位點(diǎn)974個(gè)，正常人特有的m6A位點(diǎn)1109個(gè)，共有的位點(diǎn)2793個(gè)。文章展示了m6A修飾區(qū)域的motif分析，位點(diǎn)染色體分布，統(tǒng)計(jì)了帶m6A修飾的circRNA的類型、外顯子數(shù)目，比較了兩組樣品間m6A水平和circRNA表達(dá)，并針對(duì)m6A水平差異的circRNA的功能進(jìn)行了GO和KEGG分析預(yù)測(cè)。
2）m6A水平和circRNA表達(dá)聯(lián)合分析

文章結(jié)合了RNA-seq，兩組學(xué)聯(lián)合分析展示了m6A水平與circRNA表達(dá)的關(guān)系。通過(guò)GO功能分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，進(jìn)一步挖掘了m6A水平差異的circRNA可能影響ARC的功能機(jī)制。

3）m6A相關(guān)酶對(duì)ARC的影響

通過(guò)RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)疾病組去甲基化酶ALKBH5甲基化酶METTL14差異表達(dá)，而FTO、METTL3和WTAP表達(dá)無(wú)顯著差異。通過(guò)UVB照射后qPCR和WB驗(yàn)證到ALKBH5表達(dá)水平升高，暗示 ALKBH5與疾病組m6A修飾差異有關(guān)。



云序生物-RNA修飾優(yōu)勢(shì)
國(guó)內(nèi)最早提供10分以上RNA修飾文章發(fā)表服務(wù)平臺(tái)
提供多種分子RNA修飾測(cè)序服務(wù)
云序針對(duì)m6A、m5C、m7G、m1A, ac4C等修飾提供merip/acrip測(cè)序服務(wù)，針對(duì)m5C、m7G、2’-O甲基化可以采用化學(xué)法實(shí)現(xiàn)對(duì)RNA修飾位點(diǎn)研究的單堿基分辨。
提供超微量RNA修飾測(cè)序服務(wù)
低至500ng總RNA即可完成測(cè)序
提供RNA修飾系統(tǒng)性測(cè)序服務(wù)

云序m6A RNA修飾課題技術(shù)服務(wù)五大模塊:

• m6A RNA修飾測(cè)序

MeRIP-seq
通過(guò)使用m6A抗體富集高甲基化的RNA片段，然后結(jié)合高通量測(cè)序，在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)研究發(fā)生甲基化的RNA區(qū)域

• m6A RNA修飾靶基因驗(yàn)證

MeRIP-qPCR
云序提供各類不同修飾的MeRIP-qPCR服務(wù)，可針對(duì)mRNA，lncRNA，環(huán)狀RNA等不同類型的RNA分子進(jìn)行檢測(cè)，低通量驗(yàn)證m6A修飾靶基因表達(dá)水平。

• 機(jī)制互作研究

RIP-seq/qPCR
篩選或驗(yàn)證m6A修飾直接靶點(diǎn)，研究m6A修飾靶基因的調(diào)控機(jī)制。
RNA pull down -MS/WB
篩選或驗(yàn)證目標(biāo)RNA互作基因或蛋白，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制。
雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)
驗(yàn)證兩基因互作，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制。

• RNA修飾上游酶的篩選

RNA修飾相關(guān)酶PCR芯片
尋找上游直接調(diào)控m6A甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶。

• 檢測(cè)整體m6A RNA修飾水平

LC-MS/MS檢測(cè)整體RNA修飾水平
精準(zhǔn)高效，可以實(shí)現(xiàn)一次檢測(cè)，9類修飾水平檢測(cè)，一步到位。
比色法檢測(cè)整體m6A甲基化水平
周期短、RNA起始量小，低至200ng