RRBS揭示MOF對(duì)UHRF1乙�；揎検荄NA甲基化維持的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制
DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，其在基因表達(dá)調(diào)控、基因組穩(wěn)定性和細(xì)胞分化中起著關(guān)鍵作用。UHRF1（ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1）是一種多結(jié)構(gòu)域蛋白，可作為表觀遺傳修飾因子發(fā)揮作用，能夠招募DNMT1以維持DNA甲基化。在DNA復(fù)制過程中，UHRF1通過識(shí)別半甲基化的DNA和結(jié)合組蛋白H3來定位到新合成的DNA上，并通過其E3泛素連接酶活性泛素化組蛋白H3，從而促進(jìn)DNMT1的招募和DNA甲基化的維持。然而，UHRF1乙酰化修飾及其對(duì)DNA甲基化維持的具體作用機(jī)制尚不清楚。
近日，廣東省人民醫(yī)院心血管研究所/廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究所/香港大學(xué)生物醫(yī)學(xué)院王霖晟博士等為第一作者，廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究所/香港大學(xué)生物醫(yī)學(xué)院/香港大學(xué)深圳醫(yī)院骨科中心周中軍教授、廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究所金國祥研究員為共同通訊作者，在《Cell Reports》期刊發(fā)表題為《MOF-mediated acetylation of UHRF1 enhances UHRF1 E3 ligase activity to facilitate DNA methylation maintenance》的研究論文。研究揭示了MOF（males absent on the first）對(duì)UHRF1蛋白的乙酰化修飾如何調(diào)節(jié)DNA甲基化維持過程。研究發(fā)現(xiàn)，MOF能夠乙酰化UHRF1的K670位點(diǎn)，而HDAC1（histone deacetylase 1）則能夠去乙�；撐稽c(diǎn)。這種乙�；揎椩鰪�(qiáng)了UHRF1的E3泛素連接酶活性，進(jìn)而促進(jìn)了組蛋白H3泛素化，這對(duì)于DNMT1（DNA methyltransferase 1）的招募和DNA甲基化維持至關(guān)重要。
標(biāo)題：MOF-mediated acetylation of UHRF1 enhances UHRF1 E3 ligase activity to facilitate DNA methylation maintenance（MOF介導(dǎo)的UHRF1乙�；鰪�(qiáng)了UHRF1 E3連接酶活性以促進(jìn)DNA甲基化維持）
期刊：Cell Reports
影響因子：IF 7.5/Q1
技術(shù)平臺(tái)：RRBS等（易基因金牌技術(shù)）
本研究結(jié)果表明，MOF能夠乙�；疷HRF1的K670位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于pre-RING連接區(qū)，而HDAC1則能夠去乙�；疷HRF1的同一位點(diǎn)。此外，當(dāng)K670發(fā)生突變時(shí)，MOF還可以乙�；疜667和K668位點(diǎn)。MOF/HDAC1介導(dǎo)的UHRF1乙�；芗�(xì)胞周期調(diào)控，并在G1/S期達(dá)到峰值，這與UHRF1招募DNMT1以維持DNA甲基化的功能相一致。此外，UHRF1乙�；@著增強(qiáng)了其E3泛素連接酶活性。在這些位點(diǎn)上消除UHRF1乙�；瘯�(huì)減弱UHRF1介導(dǎo)的H3泛素化，進(jìn)而影響DNMT1的招募和DNA甲基化。綜合來看，這些發(fā)現(xiàn)確定了MOF是UHRF1的乙酰轉(zhuǎn)移酶，并明確了通過MOF介導(dǎo)的UHRF1乙酰化調(diào)節(jié)DNA甲基化維持的機(jī)制。
研究亮點(diǎn)
研究摘要
研究方法
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：在HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行了一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，包括共轉(zhuǎn)染不同組的質(zhì)粒、免疫共沉淀、免疫熒光染色等，以研究UHRF1乙酰化修飾及其對(duì)DNA甲基化的影響。
體外實(shí)驗(yàn)：通過體外乙�；瘜�(shí)驗(yàn)，使用純化的GST-UHRF1和GST-MOF蛋白，驗(yàn)證了MOF對(duì)UHRF1的直接乙�；饔�。
質(zhì)譜分析：利用質(zhì)譜技術(shù)分析了MOF介導(dǎo)的UHRF1乙酰化位點(diǎn)，確定K670為主要乙酰化位點(diǎn)，同時(shí)K667和K668也可以被乙�；�
基因敲除和敲低實(shí)驗(yàn)：通過siRNA敲低MOF或在小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中敲除UHRF1，研究其對(duì)DNA甲基化的影響。
DNA甲基化分析：采用免疫熒光染色、簡(jiǎn)化基因組亞硫酸鹽測(cè)序（RRBS）等方法，分析DNA甲基化水平和模式的變化。
結(jié)果圖形
（1）MOF和HDAC1分別是UHRF1的乙酰轉(zhuǎn)移酶和去乙�；�
（B）將空載體或Myc-MOF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，對(duì)內(nèi)源性UHRF1進(jìn)行免疫沉淀，并使用UHRF1和泛乙酰化賴氨酸抗體進(jìn)行Western Blot分析。在免疫沉淀（IP）中使用免疫球蛋白G（IgG）作為UHRF1抗體的對(duì)照。
（C）通過將純化的GST-UHRF1和GST-MOF與乙酰輔酶A（acetyl-CoA）共同孵育進(jìn)行體外乙�；瘜�(shí)驗(yàn)。對(duì)照實(shí)驗(yàn)在沒有乙酰輔酶A的情況下進(jìn)行。使用乙�；嚢彼峥贵w檢測(cè)UHRF1的乙�；闆r，并通過GST抗體檢測(cè)UHRF1和MOF蛋白。
（D）將對(duì)照組和MOF小分子干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染到表達(dá)外源FLAG-Myc-UHRF1的HEK293T細(xì)胞中。使用FLAG抗體對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫沉淀，并使用針對(duì)FLAG和乙�；嚢彼岬目贵w進(jìn)行Western Blot分析。
（E）在共轉(zhuǎn)染FLAG-Myc-UHRF1和空載體或Myc-HDAC1的HEK293T細(xì)胞中，使用FLAG抗體進(jìn)行免疫沉淀，隨后使用針對(duì)泛乙�；嚢彼�、UHRF1和HDAC1的抗體進(jìn)行Western Blot分析。
（2）MOF在pre-RING連接區(qū)的K670位點(diǎn)周圍乙酰化UHRF1。
通過質(zhì)譜分析和突變實(shí)驗(yàn)，確定了MOF主要乙�；疷HRF1的K670位點(diǎn)，而K667和K668在K670突變時(shí)也可以被乙�；�。
（B）上圖展示了用于乙酰化分析的UHRF1和缺失連接區(qū)的構(gòu)建體示意圖。通過定點(diǎn)突變技術(shù)生成缺失連接區(qū)的UHRF1突變體構(gòu)建體。將UHRF1構(gòu)建體單獨(dú)或與Myc-MOF共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。使用FLAG抗體進(jìn)行免疫沉淀后，通過Western Blot分析檢測(cè)input樣本和沉淀樣本中的Myc和泛乙酰化賴氨酸。
（B）在有無MOF存在的情況下，野生型UHRF1片段（601-793氨基酸）及各種突變型UHRF1片段（601-793氨基酸）的乙�；闆r。外源性野生型UHRF1片段和不同突變型UHRF1片段經(jīng)FLAG抗體免疫沉淀后，使用泛乙�；嚢彼峥贵w進(jìn)行Western Blot分析。input樣本用Myc抗體分析外源性UHRF1片段和MOF的表達(dá)情況。
（C）在FLAG-Myc-UHRF1質(zhì)粒中，靶向K667/K668/K670賴氨酸簇進(jìn)行了賴氨酸到精氨酸的突變。將野生型或UHRF1點(diǎn)突變構(gòu)建體（均帶有FLAG-Myc標(biāo)簽）單獨(dú)或與Myc-MOF共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。使用FLAG抗體進(jìn)行免疫沉淀后，通過Western Blot分析檢測(cè)Myc和乙�；嚢彼�。
（D）通過將純化的GST-UHRF1或突變型K667R/K668R/K670R（3KR）-UHRF1和GST-MOF與乙酰輔酶A（acetyl-CoA）共同孵育進(jìn)行體外乙�；瘜�(shí)驗(yàn)。對(duì)照實(shí)驗(yàn)在沒有乙酰輔酶A的情況下進(jìn)行。使用乙�；嚢彼峥贵w檢測(cè)UHRF1的乙�；闆r，并通過GST抗體檢測(cè)UHRF1和MOF蛋白。
（3）MOF在G1期和S期乙酰化UHRF1，并促進(jìn)DNA甲基化。
UHRF1乙�；皆诩�(xì)胞周期的G1/S期達(dá)到峰值，與UHRF1招募DNMT1的功能相一致。在UHRF1的K670、K667和K668位點(diǎn)突變的細(xì)胞中，DNA甲基化水平顯著降低，表明這些位點(diǎn)的乙�；瘜�(duì)DNA甲基化維持至關(guān)重要。
（B）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染野生型FLAG-Myc-UHRF1并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MOF siRNA的HEK293T細(xì)胞通過雙重胸苷阻斷同步化，隨后進(jìn)行細(xì)胞周期釋放，并進(jìn)行與（A）相同的分析。
（C）在野生型和Uhrf1-/-小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中，以及通過FLAG-Myc標(biāo)記的野生型UHRF1（FL）或3KR或ΔRING突變體UHRF1構(gòu)建體遺傳互補(bǔ)的Uhrf1 Uhrf1-/-小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中，使用特異性5mC抗體進(jìn)行代表性免疫熒光分析。
（D）在Uhrf1 Uhrf1-/-小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中穩(wěn)定表達(dá)的FLAG-Myc標(biāo)記的人類野生型UHRF1和3KR突變體UHRF1通過西方印跡分析，使用UHRF1抗體進(jìn)行分析。β-肌動(dòng)蛋白用作加載對(duì)照。選擇兩個(gè)突變克隆和一個(gè)野生型克隆，其UHRF1表達(dá)水平與野生型ESCs中內(nèi)源性UHRF1水平相似，用于后續(xù)研究。
（E）通過RRBS測(cè)序檢測(cè)的野生型和Uhrf1 Uhrf1-/-小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）以及通過FLAG-Myc標(biāo)記的野生型UHRF1（hUHRF1）或3KR（克隆#2）UHRF1構(gòu)建體遺傳互補(bǔ)的Uhrf1-/-小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中，基因區(qū)域各個(gè)部分的全局CG甲基化水平。
（F）在對(duì)照ESCs、Uhrf1 Uhrf1-/-ESCs以及穩(wěn)定表達(dá)人類野生型或3KR突變體UHRF1的Uhrf1 Uhrf1-/-ESCs中，通過亞硫酸鹽測(cè)序分析IAP和LINE1位點(diǎn)的DNA甲基化狀態(tài)。
（4）MOF/HDAC1介導(dǎo)的UHRF1乙�；瘜�(duì)于通過H3泛素化在DNA甲基化維持過程中高效招募DNMT1至關(guān)重要
乙�；蛔兊腢HRF1不能有效地招募DNMT1到異染色質(zhì)區(qū)域，導(dǎo)致DNA甲基化缺陷。且乙�；蛔兊腢HRF1顯著降低了其對(duì)組蛋白H3的E3泛素連接酶活性，進(jìn)而影響DNMT1招募。
（B）來自至少三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的代表性Western Blot分析，用于檢測(cè)野生型小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）、Uhrf1-/-小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）以及表達(dá)外源性人類FLAG-Myc標(biāo)記的野生型UHRF1或3KR（兩個(gè)克�。┩蛔凅wUHRF1的Uhrf1-/-小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中的泛素化組蛋白H3。
（C）在HEK293T細(xì)胞中組蛋白H3.1泛素化。在存在MOF、HDAC1、MOF siRNA或HDAC1 siRNA的情況下，從HEK293T細(xì)胞中免疫沉淀的外源性FLAG-H3.1的泛素化通過Western Blot進(jìn)行檢測(cè)。將裂解液進(jìn)行FLAG抗體的免疫沉淀（IP），以沉淀外源性組蛋白H3.1，隨后使用FLAG和血凝素（HA）抗體進(jìn)行免疫印跡分析，以檢測(cè)H3.1和HA標(biāo)記的泛素。在FLAG IP樣本中顯示的HA標(biāo)記的泛素反映了FLAG-H3.1的泛素化水平。
（D）在HEK293T細(xì)胞中PML4的泛素化。將HA-PML4、Myc-UHRF1和FLAG-泛素構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，在有無MOF或HDAC1存在的情況下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在收獲前6小時(shí)用5μM MG132處理細(xì)胞。將細(xì)胞裂解液進(jìn)行HA抗體的免疫沉淀，以沉淀外源性表達(dá)的野生型HA-PML4，隨后使用HA、FLAG抗體進(jìn)行免疫印跡分析，以檢測(cè)PML4和FLAG標(biāo)記的泛素。
（5）在小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中敲低Mof會(huì)降低DNA甲基化水平。
（B）對(duì)野生型、Uhrf1-/-和Mof敲低小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中的5mC水平進(jìn)行免疫熒光染色。對(duì)內(nèi)源性H4K16ac進(jìn)行染色以反映Mof乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。
（C）通過RRBS測(cè)序檢測(cè)的野生型和Mof敲低（clone 1）小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）基因組DNA在不同基因組區(qū)域的整體CpG DNA甲基化譜。
（D）在野生型、Uhrf1-/-和穩(wěn)定敲低Mof的野生型小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中，通過亞硫酸鹽測(cè)序分析IAP和LINE1位點(diǎn)的DNA甲基化情況。
易小結(jié)
本研究揭示了MOF對(duì)UHRF1的乙酰化修飾是DNA甲基化維持的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制。UHRF1的K670、K667和K668位點(diǎn)的乙�；鰪�(qiáng)了其E3泛素連接酶活性，促進(jìn)了組蛋白H3泛素化，從而有助于DNMT1招募和DNA甲基化維持。這一發(fā)現(xiàn)不僅為理解DNA甲基化維持的分子機(jī)制提供了新視角，還可能為相關(guān)疾病的治療提供潛在靶點(diǎn)。
RRBS在本研究中的作用
RRBS（Reduced Representation Bisulfite Sequencing）是一種用于分析基因組中DNA甲基化模式的技術(shù)。在本研究中，RRBS被用于分析不同基因型小鼠胚胎干細(xì)胞（包括野生型、UHRF1敲除型和表達(dá)突變UHRF1的細(xì)胞）的全基因組DNA甲基化水平。
Xu X, Wang H, Han H, Yao Y, Li X, Qi J, Cai C, Zhou M, Tang Y, Pan T, Zhang Z, Yang J, Wu D, Han Y. Clinical characteristics and prognostic significance of DNA methylation regulatory gene mutations in acute myeloid leukemia. Clin Epigenetics. 2023 Mar 29;15(1):54. pii: 10.1186/s13148-023-01474-0. doi: 10.1186/s13148-023-01474-0.
近日，廣東省人民醫(yī)院心血管研究所/廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究所/香港大學(xué)生物醫(yī)學(xué)院王霖晟博士等為第一作者，廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究所/香港大學(xué)生物醫(yī)學(xué)院/香港大學(xué)深圳醫(yī)院骨科中心周中軍教授、廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究所金國祥研究員為共同通訊作者，在《Cell Reports》期刊發(fā)表題為《MOF-mediated acetylation of UHRF1 enhances UHRF1 E3 ligase activity to facilitate DNA methylation maintenance》的研究論文。研究揭示了MOF（males absent on the first）對(duì)UHRF1蛋白的乙酰化修飾如何調(diào)節(jié)DNA甲基化維持過程。研究發(fā)現(xiàn)，MOF能夠乙酰化UHRF1的K670位點(diǎn)，而HDAC1（histone deacetylase 1）則能夠去乙�；撐稽c(diǎn)。這種乙�；揎椩鰪�(qiáng)了UHRF1的E3泛素連接酶活性，進(jìn)而促進(jìn)了組蛋白H3泛素化，這對(duì)于DNMT1（DNA methyltransferase 1）的招募和DNA甲基化維持至關(guān)重要。
標(biāo)題：MOF-mediated acetylation of UHRF1 enhances UHRF1 E3 ligase activity to facilitate DNA methylation maintenance（MOF介導(dǎo)的UHRF1乙�；鰪�(qiáng)了UHRF1 E3連接酶活性以促進(jìn)DNA甲基化維持）
期刊：Cell Reports
影響因子：IF 7.5/Q1
技術(shù)平臺(tái)：RRBS等（易基因金牌技術(shù)）
本研究結(jié)果表明，MOF能夠乙�；疷HRF1的K670位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于pre-RING連接區(qū)，而HDAC1則能夠去乙�；疷HRF1的同一位點(diǎn)。此外，當(dāng)K670發(fā)生突變時(shí)，MOF還可以乙�；疜667和K668位點(diǎn)。MOF/HDAC1介導(dǎo)的UHRF1乙�；芗�(xì)胞周期調(diào)控，并在G1/S期達(dá)到峰值，這與UHRF1招募DNMT1以維持DNA甲基化的功能相一致。此外，UHRF1乙�；@著增強(qiáng)了其E3泛素連接酶活性。在這些位點(diǎn)上消除UHRF1乙�；瘯�(huì)減弱UHRF1介導(dǎo)的H3泛素化，進(jìn)而影響DNMT1的招募和DNA甲基化。綜合來看，這些發(fā)現(xiàn)確定了MOF是UHRF1的乙酰轉(zhuǎn)移酶，并明確了通過MOF介導(dǎo)的UHRF1乙酰化調(diào)節(jié)DNA甲基化維持的機(jī)制。
研究亮點(diǎn)
- MOF在K670位點(diǎn)乙�；疷HRF1，這一過程可被HDAC1消除。
- MOF介導(dǎo)的乙�；鰪�(qiáng)了UHRF1的E3泛素連接酶活性。
- 消除UHRF1乙�；瘯�(huì)抑制組蛋白H3泛素化及DNMT1招募。
- UHRF1的K670位點(diǎn)乙酰化為DNA甲基化維持的正常功能所必需。
研究摘要
研究方法
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：在HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行了一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，包括共轉(zhuǎn)染不同組的質(zhì)粒、免疫共沉淀、免疫熒光染色等，以研究UHRF1乙酰化修飾及其對(duì)DNA甲基化的影響。
體外實(shí)驗(yàn)：通過體外乙�；瘜�(shí)驗(yàn)，使用純化的GST-UHRF1和GST-MOF蛋白，驗(yàn)證了MOF對(duì)UHRF1的直接乙�；饔�。
質(zhì)譜分析：利用質(zhì)譜技術(shù)分析了MOF介導(dǎo)的UHRF1乙酰化位點(diǎn)，確定K670為主要乙酰化位點(diǎn)，同時(shí)K667和K668也可以被乙�；�
基因敲除和敲低實(shí)驗(yàn)：通過siRNA敲低MOF或在小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中敲除UHRF1，研究其對(duì)DNA甲基化的影響。
DNA甲基化分析：采用免疫熒光染色、簡(jiǎn)化基因組亞硫酸鹽測(cè)序（RRBS）等方法，分析DNA甲基化水平和模式的變化。
結(jié)果圖形
（1）MOF和HDAC1分別是UHRF1的乙酰轉(zhuǎn)移酶和去乙�；�
圖1：UHRF1特異性地被MOF乙�；�，并被HDAC1去乙�；�。
（A）在HEK293T細(xì)胞中共表達(dá)FLAG-Myc-UHRF1和不同的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HATs）。使用FLAG抗體對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫沉淀，并通過乙�；嚢彼峥贵w進(jìn)行免疫印跡分析以檢測(cè)乙�；腢HRF1。EV代表對(duì)照組。（B）將空載體或Myc-MOF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，對(duì)內(nèi)源性UHRF1進(jìn)行免疫沉淀，并使用UHRF1和泛乙酰化賴氨酸抗體進(jìn)行Western Blot分析。在免疫沉淀（IP）中使用免疫球蛋白G（IgG）作為UHRF1抗體的對(duì)照。
（C）通過將純化的GST-UHRF1和GST-MOF與乙酰輔酶A（acetyl-CoA）共同孵育進(jìn)行體外乙�；瘜�(shí)驗(yàn)。對(duì)照實(shí)驗(yàn)在沒有乙酰輔酶A的情況下進(jìn)行。使用乙�；嚢彼峥贵w檢測(cè)UHRF1的乙�；闆r，并通過GST抗體檢測(cè)UHRF1和MOF蛋白。
（D）將對(duì)照組和MOF小分子干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染到表達(dá)外源FLAG-Myc-UHRF1的HEK293T細(xì)胞中。使用FLAG抗體對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫沉淀，并使用針對(duì)FLAG和乙�；嚢彼岬目贵w進(jìn)行Western Blot分析。
（E）在共轉(zhuǎn)染FLAG-Myc-UHRF1和空載體或Myc-HDAC1的HEK293T細(xì)胞中，使用FLAG抗體進(jìn)行免疫沉淀，隨后使用針對(duì)泛乙�；嚢彼�、UHRF1和HDAC1的抗體進(jìn)行Western Blot分析。
（2）MOF在pre-RING連接區(qū)的K670位點(diǎn)周圍乙酰化UHRF1。
通過質(zhì)譜分析和突變實(shí)驗(yàn)，確定了MOF主要乙�；疷HRF1的K670位點(diǎn)，而K667和K668在K670突變時(shí)也可以被乙�；�。
圖2：MOF在pre-RING連接區(qū)乙�；疷HRF1
（A）上圖展示了用于乙酰化分析的野生型UHRF1和缺失不同結(jié)構(gòu)域的UHRF1突變體示意圖。將不同的Myc標(biāo)記的UHRF1構(gòu)建體單獨(dú)或與FLAG-MOF共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。使用Myc抗體進(jìn)行免疫沉淀（IP）后，通過Western Blot分析檢測(cè)input樣本和沉淀樣本中的Myc、FLAG或乙�；嚢彼帷�（B）上圖展示了用于乙酰化分析的UHRF1和缺失連接區(qū)的構(gòu)建體示意圖。通過定點(diǎn)突變技術(shù)生成缺失連接區(qū)的UHRF1突變體構(gòu)建體。將UHRF1構(gòu)建體單獨(dú)或與Myc-MOF共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。使用FLAG抗體進(jìn)行免疫沉淀后，通過Western Blot分析檢測(cè)input樣本和沉淀樣本中的Myc和泛乙酰化賴氨酸。
圖3：通過定點(diǎn)突變鑒定MOF介導(dǎo)的UHRF1乙酰化位點(diǎn)
（A）通過質(zhì)譜分析鑒定出的UHRF1中得分最高的10個(gè)乙�；嚢彼嵛稽c(diǎn)示意圖。（B）在有無MOF存在的情況下，野生型UHRF1片段（601-793氨基酸）及各種突變型UHRF1片段（601-793氨基酸）的乙�；闆r。外源性野生型UHRF1片段和不同突變型UHRF1片段經(jīng)FLAG抗體免疫沉淀后，使用泛乙�；嚢彼峥贵w進(jìn)行Western Blot分析。input樣本用Myc抗體分析外源性UHRF1片段和MOF的表達(dá)情況。
（C）在FLAG-Myc-UHRF1質(zhì)粒中，靶向K667/K668/K670賴氨酸簇進(jìn)行了賴氨酸到精氨酸的突變。將野生型或UHRF1點(diǎn)突變構(gòu)建體（均帶有FLAG-Myc標(biāo)簽）單獨(dú)或與Myc-MOF共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。使用FLAG抗體進(jìn)行免疫沉淀后，通過Western Blot分析檢測(cè)Myc和乙�；嚢彼�。
（D）通過將純化的GST-UHRF1或突變型K667R/K668R/K670R（3KR）-UHRF1和GST-MOF與乙酰輔酶A（acetyl-CoA）共同孵育進(jìn)行體外乙�；瘜�(shí)驗(yàn)。對(duì)照實(shí)驗(yàn)在沒有乙酰輔酶A的情況下進(jìn)行。使用乙�；嚢彼峥贵w檢測(cè)UHRF1的乙�；闆r，并通過GST抗體檢測(cè)UHRF1和MOF蛋白。
（3）MOF在G1期和S期乙酰化UHRF1，并促進(jìn)DNA甲基化。
UHRF1乙�；皆诩�(xì)胞周期的G1/S期達(dá)到峰值，與UHRF1招募DNMT1的功能相一致。在UHRF1的K670、K667和K668位點(diǎn)突變的細(xì)胞中，DNA甲基化水平顯著降低，表明這些位點(diǎn)的乙�；瘜�(duì)DNA甲基化維持至關(guān)重要。
圖4：UHRF1的細(xì)胞周期依賴性乙�；捌湟阴；蛔凅w對(duì)DNA甲基化維持的影響
（A）在穩(wěn)定表達(dá)FLAG-Myc-UHRF1的HEK293T細(xì)胞中，UHRF1乙�；皆诩�(xì)胞周期中的代表性水平。在細(xì)胞周期釋放后的不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞裂解物，并使用FLAG抗體對(duì)FLAG標(biāo)記的UHRF1進(jìn)行免疫沉淀。使用乙�；嚢彼岷蚿S652-UHRF1抗體分析免疫沉淀樣本中UHRF1的總乙�；蚿S652磷酸化水平。使用FLAG抗體檢測(cè)沉淀物中UHRF1的加載量。pS652-UHRF1水平用作細(xì)胞周期標(biāo)記，因?yàn)樗贕2/M期達(dá)到峰值。（B）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染野生型FLAG-Myc-UHRF1并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MOF siRNA的HEK293T細(xì)胞通過雙重胸苷阻斷同步化，隨后進(jìn)行細(xì)胞周期釋放，并進(jìn)行與（A）相同的分析。
（C）在野生型和Uhrf1-/-小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中，以及通過FLAG-Myc標(biāo)記的野生型UHRF1（FL）或3KR或ΔRING突變體UHRF1構(gòu)建體遺傳互補(bǔ)的Uhrf1 Uhrf1-/-小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中，使用特異性5mC抗體進(jìn)行代表性免疫熒光分析。
（D）在Uhrf1 Uhrf1-/-小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中穩(wěn)定表達(dá)的FLAG-Myc標(biāo)記的人類野生型UHRF1和3KR突變體UHRF1通過西方印跡分析，使用UHRF1抗體進(jìn)行分析。β-肌動(dòng)蛋白用作加載對(duì)照。選擇兩個(gè)突變克隆和一個(gè)野生型克隆，其UHRF1表達(dá)水平與野生型ESCs中內(nèi)源性UHRF1水平相似，用于后續(xù)研究。
（E）通過RRBS測(cè)序檢測(cè)的野生型和Uhrf1 Uhrf1-/-小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）以及通過FLAG-Myc標(biāo)記的野生型UHRF1（hUHRF1）或3KR（克隆#2）UHRF1構(gòu)建體遺傳互補(bǔ)的Uhrf1-/-小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中，基因區(qū)域各個(gè)部分的全局CG甲基化水平。
（F）在對(duì)照ESCs、Uhrf1 Uhrf1-/-ESCs以及穩(wěn)定表達(dá)人類野生型或3KR突變體UHRF1的Uhrf1 Uhrf1-/-ESCs中，通過亞硫酸鹽測(cè)序分析IAP和LINE1位點(diǎn)的DNA甲基化狀態(tài)。
（4）MOF/HDAC1介導(dǎo)的UHRF1乙�；瘜�(duì)于通過H3泛素化在DNA甲基化維持過程中高效招募DNMT1至關(guān)重要
乙�；蛔兊腢HRF1不能有效地招募DNMT1到異染色質(zhì)區(qū)域，導(dǎo)致DNA甲基化缺陷。且乙�；蛔兊腢HRF1顯著降低了其對(duì)組蛋白H3的E3泛素連接酶活性，進(jìn)而影響DNMT1招募。
圖5：UHRF1乙�；癁榻M蛋白H3泛素化和DNMT1招募所必需
（A）在野生型Uhrf1胚胎干細(xì)胞（ESCs）、Uhrf1-/-小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）以及表達(dá)FLAG-Myc標(biāo)記的野生型UHRF1或3KR突變體UHRF1或ΔRING突變體UHRF1的Uhrf1-/-小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中，對(duì)Dnmt1進(jìn)行免疫熒光分析。（B）來自至少三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的代表性Western Blot分析，用于檢測(cè)野生型小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）、Uhrf1-/-小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）以及表達(dá)外源性人類FLAG-Myc標(biāo)記的野生型UHRF1或3KR（兩個(gè)克�。┩蛔凅wUHRF1的Uhrf1-/-小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中的泛素化組蛋白H3。
（C）在HEK293T細(xì)胞中組蛋白H3.1泛素化。在存在MOF、HDAC1、MOF siRNA或HDAC1 siRNA的情況下，從HEK293T細(xì)胞中免疫沉淀的外源性FLAG-H3.1的泛素化通過Western Blot進(jìn)行檢測(cè)。將裂解液進(jìn)行FLAG抗體的免疫沉淀（IP），以沉淀外源性組蛋白H3.1，隨后使用FLAG和血凝素（HA）抗體進(jìn)行免疫印跡分析，以檢測(cè)H3.1和HA標(biāo)記的泛素。在FLAG IP樣本中顯示的HA標(biāo)記的泛素反映了FLAG-H3.1的泛素化水平。
（D）在HEK293T細(xì)胞中PML4的泛素化。將HA-PML4、Myc-UHRF1和FLAG-泛素構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，在有無MOF或HDAC1存在的情況下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在收獲前6小時(shí)用5μM MG132處理細(xì)胞。將細(xì)胞裂解液進(jìn)行HA抗體的免疫沉淀，以沉淀外源性表達(dá)的野生型HA-PML4，隨后使用HA、FLAG抗體進(jìn)行免疫印跡分析，以檢測(cè)PML4和FLAG標(biāo)記的泛素。
（5）在小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中敲低Mof會(huì)降低DNA甲基化水平。
圖6：在小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中敲低Mof會(huì)降低DNA甲基化
（A）通過穩(wěn)定表達(dá)兩種不同的KAT8短發(fā)夾RNA（shRNA），生成了兩條Mof（KAT8）敲低（KD）小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）系。對(duì)野生型、Uhrf1-/-和Mof敲低小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）的細(xì)胞裂解液分別用MOF和UHRF1抗體進(jìn)行免疫印跡分析。（B）對(duì)野生型、Uhrf1-/-和Mof敲低小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中的5mC水平進(jìn)行免疫熒光染色。對(duì)內(nèi)源性H4K16ac進(jìn)行染色以反映Mof乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。
（C）通過RRBS測(cè)序檢測(cè)的野生型和Mof敲低（clone 1）小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）基因組DNA在不同基因組區(qū)域的整體CpG DNA甲基化譜。
（D）在野生型、Uhrf1-/-和穩(wěn)定敲低Mof的野生型小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中，通過亞硫酸鹽測(cè)序分析IAP和LINE1位點(diǎn)的DNA甲基化情況。
易小結(jié)
本研究揭示了MOF對(duì)UHRF1的乙酰化修飾是DNA甲基化維持的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制。UHRF1的K670、K667和K668位點(diǎn)的乙�；鰪�(qiáng)了其E3泛素連接酶活性，促進(jìn)了組蛋白H3泛素化，從而有助于DNMT1招募和DNA甲基化維持。這一發(fā)現(xiàn)不僅為理解DNA甲基化維持的分子機(jī)制提供了新視角，還可能為相關(guān)疾病的治療提供潛在靶點(diǎn)。
RRBS在本研究中的作用
RRBS（Reduced Representation Bisulfite Sequencing）是一種用于分析基因組中DNA甲基化模式的技術(shù)。在本研究中，RRBS被用于分析不同基因型小鼠胚胎干細(xì)胞（包括野生型、UHRF1敲除型和表達(dá)突變UHRF1的細(xì)胞）的全基因組DNA甲基化水平。
- 單堿基分辨率檢測(cè)不同基因組區(qū)域的DNA甲基化水平，揭示UHRF1乙�；蛔儗�(duì)DNA甲基化維持的整體影響。
- 鑒定在不同細(xì)胞類型或處理?xiàng)l件下發(fā)生顯著甲基化變化的基因組區(qū)域（差異甲基化區(qū)域），為理解UHRF1在DNA甲基化維持中的作用提供了基因組學(xué)證據(jù)。
- 結(jié)合基因表達(dá)數(shù)據(jù)，分析DNA甲基化變化對(duì)基因表達(dá)的潛在影響，進(jìn)一步揭示UHRF1乙酰化在表觀遺傳調(diào)控中的功能。
Xu X, Wang H, Han H, Yao Y, Li X, Qi J, Cai C, Zhou M, Tang Y, Pan T, Zhang Z, Yang J, Wu D, Han Y. Clinical characteristics and prognostic significance of DNA methylation regulatory gene mutations in acute myeloid leukemia. Clin Epigenetics. 2023 Mar 29;15(1):54. pii: 10.1186/s13148-023-01474-0. doi: 10.1186/s13148-023-01474-0.
標(biāo)簽：
DNA甲基化
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