m5C高分-m5C甲基化修飾技術(shù)研究方向匯總

前言
RNA修飾是表觀遺傳學(xué)中調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達的關(guān)鍵過程，目前對m6A RNA甲基化的研究已進行的如火如荼，但除了m6A以外仍有多種RNA修飾類型參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因表達，其中包括m5C甲基化修飾在近期的研究中也不斷有高分文章的出現(xiàn)（如表1）。云序生物是國內(nèi)RNA修飾測序的領(lǐng)跑者，可針對mRNA和各種非編碼RNA提供各類RNA修飾測序服務(wù) (m6A﹑m1A﹑m5C﹑m7G﹑ac4C﹑2’-O-甲基化等)。目前，云序已累計支持客戶發(fā)表29篇高水平文章，合計影響因子191.25分，是國內(nèi)支持發(fā)文多、累計影響因子高的公司。
2020年10月，發(fā)表在《Trends in Plant Science》上關(guān)于m5C的文章對m5C修飾在植物發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)中的作用進行了闡述。此外也有多篇文章報道了m5C在眾多研究方向的機制。那么這個新領(lǐng)域具體有哪些進展？有哪些新型的方法思路值得我們借鑒呢？小編匯集了多篇m5C修飾文章，帶大家把握這一領(lǐng)域的新進展。

文章內(nèi)容
1. m5C——m5C修飾的控制植物發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)
發(fā)表期刊：Trends in Plant Science
影響因子：14.416
發(fā)表時間：2020.10
文章鏈接：RNA5-Methylcytosine Controls Plant Development and Environmental Adaptation 
盡管對RNA上的5-甲基胞嘧啶(m5C)在哺乳動物中的研究越來越多，但m5C在植物中的功能仍然不清楚。先前有研究者提出了m5C在植物發(fā)育和脅迫適應(yīng)中的動態(tài)功能，此外Tang等研究者現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RNA m5C甲基轉(zhuǎn)移酶在水稻高溫適應(yīng)中的作用。目前，已有幾種新的方法被應(yīng)用于RNA m5C的鑒定包括MeRIP-seq，RNA-BisSeq， Aza-IP和miCLIP，其中最后兩個方法尚未應(yīng)用于植物。最近使用m5C-RIP-seq、RNA- Bis-seq和Nanopore-seq研究了m5C表達譜及其在植物RNA代謝、發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)中的作用。本文通過m5C在擬南芥和水稻mRNA中的位置、功能和靶向性的探討，表明了m5C在擬南芥和水稻根系發(fā)育調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。
2. m5C——m5C修飾的mRNA造成DNA損傷促進了同源重組
發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：12.121
發(fā)表時間：2020.06.05
文章鏈接：m5C modification of mRNA serves a DNA damage code to promote homologous recombination
補充DNA修復(fù)蛋白到DNA損傷部位是DNA修復(fù)的關(guān)鍵步驟。DNA損傷位點的轉(zhuǎn)錄后修飾造成DNA錯誤編碼從而招募了特定的DNA修復(fù)因子。文中作者發(fā)現(xiàn)m5C在DNA損傷位點對mRNA進行了局部修飾。RNA甲基轉(zhuǎn)移酶TRDMT1被招募到DNA損傷位點并促進m5C的修飾。TRDMT1的缺失破壞了同源重組(HR)并增加了細(xì)胞對DNA雙鏈斷裂(DSBs)的敏感性。在沒有TRDMT1的情況下，RAD51和RAD52無法定位到活性氧(ROS)誘導(dǎo)的DNA損傷位點。在體外，含有m5C修飾的RAD52對DNA的親和力增強。腫瘤細(xì)胞中TRDMT1的缺失使其在體內(nèi)和體外對PARP抑制劑更敏感。這些結(jié)果揭示了TRDMT1- m5C修飾能促進同源重組（HR），說明RNA轉(zhuǎn)錄后修飾也可以造成DNA損傷從而調(diào)節(jié)DNA修復(fù)。
3. m5C——RNA測序提出對擬南芥轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性的新見解
發(fā)表期刊：Nucleic Acids Research
影響因子：11.5
發(fā)表時間：2020.08.20
文章鏈接：New insights into Arabidopsis transcriptome complexity revealed by direct sequencing of native RNAs
擬南芥轉(zhuǎn)錄組在不同條件下得到了廣泛的研究和鑒定。然而，目前大多數(shù)的“RNA測序”技術(shù)都產(chǎn)生了相對較短的閱讀長度，并且需要一個反轉(zhuǎn)錄步驟，從而阻礙了對轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性的有效表征。本文，作者使用新的牛津納米孔技術(shù)(ONT)進行了具有特殊讀取長度的直接RNA測序(DRS)。證明了擬南芥轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性被大大低估了。用ONT直接進行RNA測序在營養(yǎng)和生殖發(fā)育階段鑒定了新的轉(zhuǎn)錄子亞型。作者使用TrackCluster軟件確定了可變轉(zhuǎn)錄起始(ATI)、可變多聚腺苷酸化(APA)、可變剪接(AS)和融合轉(zhuǎn)錄。并鑒定了超過38500個新的轉(zhuǎn)錄亞型，包括六類可能由不同的RNA加工機制導(dǎo)致的融合轉(zhuǎn)錄。此外，通過Tombo算法，作者發(fā)現(xiàn)mRNA中有豐富的m5C修飾，這與最近發(fā)現(xiàn)的mRNA中m5C修飾對其長距離移動至關(guān)重要的發(fā)現(xiàn)相一致。綜上所述，ONT-DRS在新型RNA亞型和RNA堿基修飾的識別和功能表征方面具有優(yōu)勢，并明顯改善了對擬南芥基因組的注釋。
4. m5C——長期m5C甲基化動力學(xué)在藍藻中的表型適應(yīng)
發(fā)表期刊：MOLECULAR BIOLOGY AND EVOLUTION
影響因子：11.062
發(fā)表時間：2020.10.06
文章鏈接：Long-term m5C methylome dynamics parallel phenotypic adaptation in the cyanobacterium Trichodesmium
現(xiàn)代生物學(xué)的一個主要挑戰(zhàn)是理解短期生物反應(yīng)如何影響長期進化適應(yīng)，長期進化適應(yīng)被定義為對新環(huán)境適應(yīng)能力的基因改變。由于它們對食物網(wǎng)、生物地球化學(xué)循環(huán)和氣候的影響，這對于正在經(jīng)歷快速變化的全球重要微生物尤其重要。甲基化等表觀遺傳修飾已被證明會影響短期的生物反應(yīng)，最終影響對環(huán)境變化的長期適應(yīng)反應(yīng)。然而，對于非模式的、具有重要生態(tài)意義的微生物在環(huán)境適應(yīng)過程中長期甲基化動力學(xué)的實證研究仍然很少。本文中作者展示了在海洋原核生物中第一個經(jīng)驗證據(jù)，作者使用一個與生物地球化學(xué)上重要的海洋藍細(xì)菌進行了7年的進化實驗(1000多代)證實了長期m5C的甲基修飾與對CO2的表型適應(yīng)相關(guān)。此外，作者也確定了m5C的甲基化位點，這些位點在高濃度CO2下迅速變化，并且在CO2選擇過程中至少保持了4.5年。然而，經(jīng)過7年的CO2選擇后，最初對高CO2有反應(yīng)的m5C甲基化水平回到了跟過去的環(huán)境CO2相同的水平。與此同時，無論CO2濃度如何，高CO2適應(yīng)細(xì)胞系的生長和N2固定率都明顯高于環(huán)境CO2適應(yīng)細(xì)胞系，這與遺傳同化理論相一致。這些數(shù)據(jù)表明，在回到祖先的甲基化水平之前，CO2響應(yīng)m5C的甲基化維持了4.5年，同時表型也在適應(yīng)環(huán)境的變化。這項研究中對全球分布的海洋原核生物的觀察為全球變化下的生物地球化學(xué)重要特征提供了關(guān)鍵的進化見解。
5. m5C——泛癌分析揭示了m5C調(diào)節(jié)因子的基因改變、分子機制和臨床相關(guān)性
發(fā)表期刊：Clinical and Translational Medicine
影響因子：7.919
發(fā)表時間：2020.09.10 
文章鏈接：A pan-cancer analysis reveals genetic alterations, molecular mechanisms, and clinical relevance of m5C regulators
RNA修飾是由三個調(diào)節(jié)因子的協(xié)同作用決定的：甲基轉(zhuǎn)移酶(Writer)，RNA結(jié)合蛋白(Reader)，和去甲基化酶(Eraser)。目前，m5C調(diào)控過程由8個甲基轉(zhuǎn)移酶和2個RNA結(jié)合蛋白組成，m5C的去甲基酶目前尚未被識別。目前的證據(jù)表明，這些調(diào)節(jié)因子介導(dǎo)的m5C參與了細(xì)胞分化和凋亡。編碼這些調(diào)控因子的基因突變與各種人類疾病有關(guān)，在許多癌癥中已經(jīng)觀察到表達水平的變化。然而，m5C調(diào)控因子在癌癥中的作用仍然不明確。因此，研究m5C調(diào)控因子對多種癌癥治療靶點的基因改變和功能紊亂具有重要價值。本文中作者從TCGA數(shù)據(jù)庫中收集了33種癌癥的數(shù)據(jù)，并選取至少2個正常對照的23例腫瘤進行差異表達分析，發(fā)現(xiàn)四種調(diào)控因子(NSUN1、NSUN2、NSUN5和ALYREF)在大多數(shù)癌癥中表達明顯上調(diào)，而其他調(diào)控因子表達略有改變。同時，進行t檢驗分析發(fā)現(xiàn)與TCGA數(shù)據(jù)庫中的正常對照相比，這四種調(diào)控因子在多種癌癥中明顯高表達。綜上所述，作者的研究強調(diào)了m5C在泛癌中的作用，也為后續(xù)其他研究人員挖掘和驗證提供理論依據(jù)。
6. m5C——結(jié)合多個序列特性預(yù)測RNA序列中m5C的修飾
發(fā)表期刊：Molecular Therapy
影響因子：7.032
發(fā)表時間：2020.09.04 
文章鏈接：Prediction of m5C Modifications in RNA Sequences by Combining Multiple Sequence Features
5-甲基胞嘧啶(m5C)是一種眾所周知的轉(zhuǎn)錄后修飾，在RNA代謝、tRNA識別和應(yīng)激反應(yīng)等生物過程中發(fā)揮重要作用。傳統(tǒng)的識別m5C位點的高通量技術(shù)通常耗時且昂貴。此外，在后基因組時代，RNA序列的數(shù)量呈現(xiàn)爆炸性增長。因此，迫切需要基于計算機學(xué)習(xí)的方法來快速、高精度地預(yù)測RNA 的m5C修飾。文章中提出了一個新的基于SVM的工具，稱為iRNA-m5C_SVM，通過結(jié)合多個序列特征來識別擬南芥中m5C位點。首先對常用的8種特征提取方法進行了系統(tǒng)研究。然后，選取四個表現(xiàn)良好的特征來構(gòu)建一個綜合模型，包括位置特異性、核苷酸組成、三核苷酸的電子-離子相互作用電位和一般平行相關(guān)的二核苷酸組成。10倍以上的交叉驗證和獨立檢驗的評估準(zhǔn)確率分別達到73.06%和80.15%，表明在現(xiàn)有模型中對擬南芥內(nèi)m5C位點的預(yù)測性能很好。本文中提出的模型可以成為進一步研究植物中m5C修飾位點的一個很有前景的選擇。 云序生物m5C修飾研究五大模塊
1. m5C RNA修飾測序
m5C RNA修飾測序（m5C-seq）
對m5C RNA甲基化修飾測序，目前流行的檢測手段為m5C meRIP-Seq和Bis-seq，這兩種方法均適用于m5C RNA甲基化譜研究，快速篩選m5C RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m5C測序：

• m5C 全轉(zhuǎn)錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）
• m5C LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）
• m5C Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）
• m5C mRNA測序

2. 檢測整體m5C RNA修飾水平
LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
準(zhǔn)確高效，可以實現(xiàn)一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
3. m5C RNA修飾上游酶的篩選
m5C RNA修飾相關(guān)酶PCR芯片
尋找上游直接調(diào)控m5C RNA甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶。
4.m5C RNA修飾靶基因驗證
meRIP-qPCR
云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務(wù)，可針對mRNA，lncRNA，環(huán)狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。
5. 機制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調(diào)控機制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
篩選或驗證目標(biāo)RNA互作基因或蛋白，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機制。
5.3 雙熒光素酶實驗
驗證兩基因互作，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機制。