腫瘤細胞中ecDNA新機制在斯坦福大學致癌基因研究的應用

eccDNA是染色體外的一種特殊的環(huán)狀DNA，從它的出現(xiàn)至今已長達數(shù)年，但在起初的很長一段時間里并未得到人們的重視。隨著高通量技術的發(fā)展，eccDNA(extrachromosomal circular DNAs，eccDNAs)作為染色體外的環(huán)狀DNA的研究也進一步深入。在國際學術期刊《Nature》和《Cell》上相繼發(fā)表的關于eccDNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要功能的報道使eccDNA成為了基因組學研究中的一個爆點。這兩篇文章中認為eccDNA能夠促進腫瘤細胞中原癌基因的表達，這一重要發(fā)現(xiàn)使eccDNA成為科研界關注的熱點話題。

然而關于eccDNA在腫瘤細胞內的空間位置及作用機理仍未可知。近期，美國斯坦福大學研究團隊在bioRxiv 預先發(fā)表了一篇題目為“EcDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression”的文章，對癌癥細胞中ecDNA hubs（ecDNA聚集成簇）在致癌基因的表達中發(fā)揮重要的作用提出了一個新的分子機制，這為解析ecDNA在癌癥細胞中的作用提出一個新方向，也為癌癥治療提供了新的理論基礎。 發(fā)表平臺： bioRxiv 
發(fā)表日期： 2020.11.20
實驗方法:  WGS, RNA-seq, ChIP（以上服務云序均可提供）
文章鏈接：EcDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression 此前研究發(fā)現(xiàn)ecDNA是大小約100kb-幾Mb的雙鏈環(huán)狀DNA。由于其自身沒有著絲粒，因此在細胞分裂中可隨機分配到子細胞，這一特性使ecDNA在腫瘤耐藥性方面發(fā)揮作用。而且，ecDNA也可以重新整合到染色體上或者形成重復序列（HSRs）。此外，ecDNA相比于染色體DNA有更加松散的結構，更適于其攜帶的致癌基因的轉錄和表達。ecDNA存在于正常染色體之外，其在細胞核中的空間組織目前還不清楚。但值得注意的是，ecDNA在某些生物學過程之后會發(fā)生聚集。本文中作者展示了由10-100個ecDNA聚集組成的ecDNA簇，它們聚集在間期細胞核內，驅動分子間增強子的重排從而驅動致癌基因表達。本研究中，通過檢測在MYC-PVT1融合基因的ecDNA空間、表觀和轉錄水平的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)ecDNA hubs作為一個組合的增強子集合體，對致癌基因的轉錄發(fā)揮調控。 （1）ecDNA hubs是癌基因轉錄的主要位點
為了了解ecDNA在轉錄過程中的空間背景，作者使用DNA熒光原位雜交技術（FISH）分別在前列腺癌（PC3）、結直腸癌（COLO320-DM）、膠質母細胞瘤（HK359）以及胃癌（SNU16）中可視化了ecDNA在間期期間在細胞核中的定位，發(fā)現(xiàn)這些ecDNA是幾十到幾百個聚集在間期細胞的細胞核的特定區(qū)域，這表明ecDNA 相互之間具有很強的聚集性，稱之為ecDNA hubs。為了評估ecDNA hubs的轉錄活性，作者結合了DNA和新生RNA利用FISH檢測了在PC3和COLO320-DM細胞系中MYC等位基因的轉錄活性，發(fā)現(xiàn)ecDNA  hubs上致癌基因的轉錄的概率明顯高于染色體位點，且發(fā)現(xiàn)MYC轉錄概率與ecDNA聚類之間有顯著的相關性。因此，當更多的ecDNA在同一細胞聚集時，ecDNA hubs更有可能轉錄癌基因。 （2）單細胞水平識別與強效癌基因表達相關的ecDNA增強子
為了了解ecDNA上致癌基因表達的調控，作者在單細胞水平上鑒定了與癌基因高表達相關的ecDNA上的調控元件并檢測了癌細胞的異質性，以及ecDNA與癌基因轉錄的關系。作者采用單細胞組學的方法，使用ATAC- seq和RNA-seq共檢測到結直腸癌細胞系col320 -DM和COLO320-HSR中72049個細胞獲得的轉錄組和染色質開放性圖譜。進一步整合了每個細胞的轉錄組和染色質開放性圖譜，發(fā)現(xiàn)MYC的開放性隨RNA表達而增加。MYC在COLO320-DM中的表達與開放性相比于COLO320-HSR是高度異質的。這些結果表明，調控元件可以影響ecDNA在癌基因表達中的細胞間差異。為了鑒定細胞中表達高水平MYC的ecDNA上的活性調控元件，ATAC-seq比較表明，高MYC表達的COLO320-DM細胞既包含更高的ecDNA拷貝數(shù)，也包含更多的調控元件，在ecDNA上的差異峰分析鑒定出47個與MYC高表達密切相關的調控元件，而在染色體HSRs上鑒定出5個調控元件，這些結果表明，MYC 轉錄的增加與ecDNA中許多調節(jié)元件有關�？傊�，這些結果表明，細胞間增強子的差異可能是ecDNA 癌基因表達異質性的關鍵。 （3）增強子和啟動子之間的分子間互作促進ecDNA 的異質化和致癌基因的表達
由于發(fā)現(xiàn)(i)細胞核內的ecDNA hubs與活躍的癌基因表達相關，(ii) ecDNA的癌基因表達與差異調節(jié)元件相關，作者下一步研究這些差異元件是否參與不同的ecDNA分子之間的增強子-啟動子相互作用。作者整合了WGS、單分子DNA測序和3D 增強子連接體圖譜，分析ecDNA  hubs對致癌基因表達的調控。先根據(jù)之前的WGS的數(shù)據(jù)，檢測COLO320-DM細胞中ecDNA在MYC位點有重排，確定了PVT1能和MYC的外顯子2和3發(fā)生融合，并采用nanopore三代單分子測序的方法進行了驗證，結果顯示ecDNA分子在COLO320-DM中存在高度的異質性。隨后采用HiChIP檢測了COLO320-DM和COLO320-HSR中H3K27ac與激活型增強子和ecDNA的作用，發(fā)現(xiàn)在ecDNA的拷貝數(shù)高的COLO320-DM中H3K27ac與激活型增強子結合越緊密。此外，通過ATAC-seq鑒定了大量的激活型增強子，結果發(fā)現(xiàn)其與MYC基因有相互作用。綜上結果，作者認為增強子和啟動子之間的互作促進ecDNA的異質化和致癌基因的表達。 （4）BRD4連接ecDNA hubs并驅動癌基因轉錄
廣泛的遠距離接觸和H3K27ac相關的DNA接觸提高了BET蛋白可能參與ecDNA hubs轉錄的可能性。BET是染色質閱讀蛋白，為了檢測BET蛋白在ecDNA促進轉錄作用，檢測在兩種細胞中MYC位點BRD4的定位情況。根據(jù)H2K27ac，BRD4的ChIP-seq結果和ATAC-seq數(shù)據(jù)，表明H3K27ac 存在的激活的ecDNA增強子，與BRD4同時存在，BRD4連接ecDNA hubs，促進致癌基因的轉錄。為了評估BET抑制劑JQ1在ecDNA hubs的功能中作用，作者進行了JQ1處理，發(fā)現(xiàn)加入JQ1后ecDNA出現(xiàn)分散，且具有細胞特異性。而加入RNA PolII抑制劑，降低MYC的轉錄但不影響ecDNA hubs的聚集。通過新生RNA和DNA FISH和BRD4的ChIP-seq結果表明ecDNA hubs的形成依賴于BET蛋白，而ecDNA hubs的破壞會引起MYC致癌基因轉錄的抑制和ecDNA癌細胞的死亡。除了BET的抑制劑會抑制ecDNA的轉錄，作者還發(fā)現(xiàn)CRISPR的干擾劑，也可以抑制PVT1的啟動子，降低PVT1-MYC的轉錄從而降低總的MYC的RNA水平。這一結果顯示ecDNA可能是調控致癌基因表達的一個更有效的思路。
（5）EcDNA hubs調控兩個癌基因位點的分子互作
上述研究證明ecDNA hubs可能促進分子間增強子-啟動子相互作用。為了驗證這些相互作用，作者對人類胃癌細胞系中兩種類型的ecDNA進行了研究，一種ecDNA包含來自8號染色體的MYC擴增子，另一種包含來自10號染色體的FGFR2擴增子。用FISH分析表明，MYC和FGFR2 ecDNA在間期中心區(qū)共表達。后續(xù)作者在細胞上使用H3K27ac HiChIP來檢測增強子-啟動子的相互作用。這些結果說明分子間的相互作用對于致癌基因的表達非常重要。 本文研究發(fā)現(xiàn)癌細胞中攜帶癌基因的ecDNA成簇出現(xiàn)，形成ecDNA hubs。這種ecDNA hubs促進了新的增強子-啟動子相互作用和癌基因表達。反過來，這些增強子在癌基因間的不同導致細胞間的異質性。此外，ecDNA hubs可能還涉及不同ecDNA分子上的轉錄調控元件,這些轉錄調控元件也可能調控遠距離的基因表達。這一發(fā)現(xiàn)在ecDNA上的癌基因調控如何有助于致癌基因轉錄和癌細胞的異質性上有重要意義。

云序生物eccDNA測序
eccDNA測序（別名：Circle-Seq﹑環(huán)狀DNA測序）是eccDNA檢測利器，可以高通量地對檢測樣品中的所有eccDNA，具有檢出率高﹑準確性好等優(yōu)點。云序生物eccDNA測序采用多種方法高效地富集和擴增eccDNA，簡述如下：首先，利用A&A Biotechnology離子交換柱（云序生物是A&A Biotechnology品牌全線產品的全國總代理）高效富集基因組DNA中的eccDNA，然后利用核酸酶進一步對富集的eccDNA進行消化除去殘余線性DNA。富集純化后，通過滾環(huán)擴增獲得大量的eccDNA拷貝,再利用NGS測序高通量地檢測樣品中所有的環(huán)狀DNA分子。嚴謹?shù)膶嶒灹鞒�，極大地提高了eccDNA的檢出率和檢測靈敏度。最后，通過嚴謹?shù)膃ccDNA生信流程，實現(xiàn)了對eccDNA準確的識別和詳細的基因注釋,快速找到癌癥、腫瘤等疾病機理研究和診斷的靶向eccDNA。       
云序生物eccDNA測序優(yōu)勢
1.國內首推eccDNA測序服務
云序生物是國內最早提供eccDNA測序服務的公司，云序在2018年已啟動了eccDNA測序技術的開發(fā)。迄今為止，我們已經完成上千例樣品的eccDNA測序，積累了豐富的項目經驗，樣品類型涵蓋：組織﹑細胞﹑血清﹑血漿﹑尿液等，物種涵蓋：人﹑小鼠﹑大鼠﹑擬南芥﹑果蠅﹑酵母﹑非洲爪蟾等。 √ 云序產品1：eccDNA測序
作用：通過NGS測序高通量地檢測和識別樣品中的所有eccDNA。
√ 云序產品2：eccDNA Outward PCR驗證
作用：通過核酸外切酶處理和Outward PCR驗證eccDNA的環(huán)形結構。 √ 云序產品3：eccDNA Sanger測序
作用：通過金標準的Sanger測序，驗證eccDNA特異性的junction位點。
3.專業(yè)的生信分析
云序生物對eccDNA進行專業(yè)細致的注釋，提供eccDNA的染色體信息﹑坐標信息﹑長度信息﹑反式剪切位點信息﹑序列信息﹑對應的基因信息﹑基因的GO條目及KEGG信號通路注釋信息等，為后續(xù)的研究提供了重要線索和便利。
云序eccDNA生信示例：

1）eccDNA表達和差異分析

2）eccDNA整體統(tǒng)計

 

3）eccDNA功能預測

高質量的數(shù)據(jù)
云序生物嚴謹?shù)膶嶒灹鞒毯蛯�業(yè)的數(shù)據(jù)分析保證了高質量的結果，eccDNA測序數(shù)據(jù)與Sanger驗證結果完美吻合，實測數(shù)據(jù)示例如下：

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