通過小腸上皮細胞（IEC）來調節(jié)T細胞分化（IEL）的分子機制

 

腸道是人體重要的消化吸收的場所，也是最大的免疫器官。腸道微生物組、免疫細胞和粘膜屏障共同筑成了腸道上皮的穩(wěn)態(tài)，是人體健康的重要防線之一。這里和大家一起精讀一篇發(fā)表在Journal of Experimental Medicine雜志上的文獻，該研究首次揭示了通過小腸上皮細胞（IEC）來調節(jié)T細胞分化（IEL，上皮內(nèi)淋巴細胞）的分子機制，此外，研究發(fā)現(xiàn)微生物群對于小腸中MHCII和PD-L1以及IEL的上皮分化至關重要。

 

小腸中，經(jīng)典CD4+ T細胞可分化為CD4+ CD8αα+上皮內(nèi)淋巴細胞（intraepithelial lymphocytes, IELs），但是它們周圍的小腸上皮細胞（intestinal epithelial cells，IECs）在其中的作用還不明確。近日，Dr. Moon帶領的韓國團隊研究發(fā)現(xiàn)：在小腸遠端，IECs在微生物群和IFN-γ的刺激下能通過表達MHC II類分子和程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1），提供生態(tài)龕（niche）適應信號，來促進CD4+CD8αα+IELs（DP IELs）的分化。 這一研究結果發(fā)表在了Journal of Experimental Medicine雜志上[1]。

 

備注：下文中的SP表示CD4+單陽性（single positive）細胞；DP表示CD4+CD8+ 雙陽性（double positive）細胞。

 

IELs的分化需要IECs上MHC II的表達

為了探究IECs在DP IELs分化過程中起到了非典型APC的作用，研究者們分析了C57BL/6野生型小鼠小腸不同部位中，MHC II在IECs上的表達情況。一系列的流式實驗、RNA-seq實驗都顯示IECs在DP IELs分化過程中的作用與MHC II抗原呈遞相關。此外，為了弄清楚IECs表達的MHC II在DP IELs分化中的作用，研究者們使用了一種特異性在IECs中敲除了MHC II的小鼠（MHC II△IEC），并通過與MHC IIfl/fl對照組小鼠相比，證實了IELs的分化需要IECs上MHC II的表達（圖1G-H）。

圖1G-H. 流式（G）和免疫熒光實驗（H）都顯示：與MHC IIfl/fl對照組小鼠相比，MHC II△IEC小鼠的DP IELs在SP IELs細胞中的比例顯著下降。此外，免疫熒光實驗（H）顯示，大部分DP IELs都與高表達MHC II的上皮細胞的基底外側面相接觸。

 

MHC II在IECs上的表達依賴于IFN-γ的存在

有報道顯示IFN-γ在非造血細胞（例如IECs）中能強效誘導MHC II的表達。為了進一步驗證這個結論，研究者們使用了一款IFN-γ受體敲除小鼠（IFN-γR−/−）。與前人的實驗結論一致：在IFN-γR−/−小鼠的IECs上，未檢測到MHC II的表達，而且DP IELs分化嚴重受阻，其在SP T細胞中的比例幾乎為0（圖2A）；在野生型小鼠中，加入anti-IFN-γ抗體后，MHC II的表達水平以及DP在SP IELs細胞中的比例都顯著降低（圖2B）。此外，有報道顯示IFN-γ是DP IELs分化所必需的：它能通過誘導轉錄因子T-bet的表達，促進DP IELs的分化。這說明IFN-γ在DP IELs的功能成熟中起到了重要作用。

圖2A-B. IFN-γ在非造血細胞（例如IECs）中能強效誘導MHC II的表達。

 

為了探究IELs和IECs中，IFN-γ對DP IELs分化的影響，研究者們構建了骨髓（Bone marrow，BM）嵌合體小鼠：從供體小鼠的腿骨中取得BM細胞，靜脈注射到經(jīng)致死劑量輻照后的受體小鼠體內(nèi)（供體小鼠的造血細胞→受體小鼠），8周造血重建期過后處死受體小鼠。結果顯示（圖2C）：無論是在造血細胞（例如CD4+IELs），還是非造血細胞（例如IECs）中，DP IELs的分化都需要完整的IFN-γR信號。此外，之前在野生型小鼠中觀察到的不同小腸部位中MHC II表達量和DP IELs比例的明顯差異，在BM嵌合型小鼠中都未能觀測到。研究者們推測這有可能是因為免疫重建后的受體小鼠比穩(wěn)態(tài)時產(chǎn)生了更多的IFN-γ，而這改變了腸道微環(huán)境，使其炎癥化，因此消除了這種區(qū)域性差異。

圖2C. DP IELs的分化需要完整的IFN-γR信號。

 

為了直接探究MHC II+IECs是否在DP IELs分化中起到了非典型APC的作用，研究者們構建了分別來源于IFN-γR+/+小鼠和IFN-γR−/−小鼠的小腸類器官（orgnoids）。他們首先驗證了IFN-γ在類器官中能發(fā)揮與體內(nèi)一致的效果：IFN-γ能強效誘導類器官中IECs上MHC II的表達（圖2D-E）。此外，有研究顯示，T-box expressed in T cells （T-bet）是DP IELs分化過程中的重要上游調控因子，它能誘導Runx3的表達并抑制ThPOK 的表達；而T-bet誘導產(chǎn)生的細胞因子（例如IFN-γ）在腸道微環(huán)境刺激因子的存在下，能進一步促進DP IELs的分化。因此，研究者們在腸道微環(huán)境刺激因子TGF-β和視黃酸（Retinoic acid,RA）存在的情況下，將經(jīng)IFN-γ和卵清白蛋白多肽（ovalbumin peptide，OVAp）預刺激后的小腸類器官，以及經(jīng)anti-CD3ε/CD28預刺激后的OVA特異性CD4+ T細胞（OT-II）進行24h共培養(yǎng)（圖2F）。結果顯示：IFN-γ能誘導MHC II大量表達；MHC II+IECs在DP IELs分化中起到了非典型APC的作用，且TGF-β和RA刺激能進一步促進DP IELs的分化。

圖2D-E. 流式（D）和免疫熒光實驗（E）顯示：進行IFN-γ刺激后，IFN-γR+/+小鼠來源的類器官IECs上的MHC II表達水平顯著升高，而IFN-γR−/−小鼠來源的類器官IECs上的MHC II不表達。

 

圖2F-G. 共培養(yǎng)實驗示意圖（F）；IECs上MHC II的表達情況（G左）；DP在SP OT-II細胞中的比例（G右）。

 

IECs上經(jīng)IFN-γ誘導產(chǎn)生的PD-L1在DP IELs分化中起到重要作用

通過上述實驗知道MHC II+IECs能作為APC對CD4+IELs進行同源刺激后，研究者們推測它們也能表達其他能與MHC II一起協(xié)同調節(jié)T細胞的共受體。此外，由于MHC II在IECs上的表達依賴于IFN-γ的存在，研究者們進一步推測這些共受體應該與IECs中的IFN-γ信號有關。對經(jīng)IFN-γ處理或不處理的小腸類器官進行RNA-seq分析，研究者們發(fā)現(xiàn)編碼PD-L1蛋白的Cd274基因與MHC II關聯(lián)基因的表達顯著相關（圖3A-B）。類器官實驗（圖3C）和體內(nèi)實驗（圖3D-E）都表明IFN-γ能顯著影響PD-L1表達量。為了進一步證實DP IELs分化需要IECs上PD-L1的表達，研究者們使用了PD-L1敲除小鼠（PD-L1−/−）、RAG-1敲除小鼠（RAG-1−/−，小鼠無成熟T、B細胞）、特異性在IECs中敲除了PD-L1目的基因的小鼠（PD-L1△IEC）以及由賽業(yè)生物構建的PD-L1fl/fl對照組小鼠。一系列實驗結果（圖F-H）都顯示IECs上的PD-L1在DP IELs分化中起到了重要作用。

圖3A-B. 差異表達基因熱圖（A）和火山圖（B）。

 

圖3C-E. （C）經(jīng)不同濃度IFN-γ處理后，小腸類器官PD-L1的表達量;（D）與IFN-γR+/+小鼠對比，IFN-γR−/−小鼠中的PD-L1表達量顯著降低；（E） 在IFN-γR+/+小鼠體內(nèi)注射anti-IFN-γ抗體后，IECs上PD-L1的表達量顯著降低。

 

圖3F-H. （F）與PD-L1+/+小鼠對比，在PD-L1−/−小鼠回腸中，DP IELs比例明顯下降；（G）將脾CD4+ T細胞輸入到RAG-1−/−小鼠體內(nèi)后，在小鼠體內(nèi)加入anti-PD-L1抗體，DP IELs發(fā)育受阻；（H）與PD-L1fl/fl小鼠對比，在PD-L1△IEC小鼠回腸中，DP IELs比例明顯下降。

 

微生物群對小腸中MHC II和PD-L1的表達以及DP IELs的分化至關重要

有報道顯示小腸中IFN-γ的產(chǎn)生以及IECs上MHC II的表達都需要微生物群，因此，為了探究IECs上PD-L1的表達是否受到微生物群調控，研究者們使用了無菌（Germ-free，GF）小鼠、無特定病原體級（specific pathogen–free，SPF） 小鼠進行實驗。這些實驗結果表明：微生物群誘導產(chǎn)生的IFN-γ能刺激IECs表達MHC II和PD-L1，而這兩者可以調節(jié)DP IELs的分化。

圖4A. 與SPF小鼠對比，GF小鼠IECs上PD-L1的表達水平在回腸中顯著降低、MHC II表達量和DP IELs比例在小腸各部位顯著下降，特別是在回腸中。

 

圖4B. 進行抗生素處理后，SPF小鼠中IECs上PD-L1的表達水平在回腸中顯著降低、MHC II表達量和DP IELs比例在小腸各部位顯著下降，特別是在回腸中。

 

圖4C. 免疫熒光實驗顯示：SPF小鼠回腸中的IECs大多數(shù)都表達MHC II，20%表達PD-L1；而GF小鼠中，MHC II和PD-L1的表達量都顯著降低。

 

PD-1信號通過抑制ThPOK表達來刺激DP IELs的分化

經(jīng)典CD4+ T細胞和CD8+ T細胞分別靠表達T helper–inducing POZ/Krüppel-like factor （ThPOK）和runt-related transcription factor 3 （Runx3）來維持自身譜系。因此，DP IELs的分化需要Runx3表達量的上調和ThPOK的缺失。此外，IECs上MHC II和PD-L1的表達都對DP IELs的分化至關重要，這表明TCR和PD-1釋放的信號可能參與了CD4+IECs的細胞重編程。前期實驗結果顯示：T細胞內(nèi)源性的PD-1信號對DP IELs的分化是必需的（圖5A-C）。為了進一步探究其中的分子機制，研究者們使用了ThPOK-GFP報告小鼠。實驗結果顯示：PD-1對ThPOK表達的抑制和DP IELs的分化需要PD-1信號的存在（圖5D-E）。此外，體外實驗結果（圖5G-I）顯示：PD-1信號通過經(jīng)典的Src homology 2 domain–containing tyrosine phosphatase （SHP） 通路來下調CD4+IECs中ThPOK的表達，從而促進DP IELs的分化。

圖5A-C. （A）C57BL/6野生型小鼠中，PD-1在不同IEL亞群中的表達情況。當SP IELs向DP IELs分化時，PD-1表達量下降。（B）與PD-L1+/+小鼠對比，在PD-L1−/−小鼠小腸中，DP IELs比例明顯下降。（C）將來自于PD-L1+/+小鼠和PD-L1−/−小鼠的脾CD4+ T細胞1:1混合后，移植到RAG-1−/−受體小鼠體內(nèi)。來源于PD-L1−/−CD4+ T細胞的DP IELs比例明顯降低。

 

圖5D-F. （D）實驗示意圖：將來源于ThPOK-GFP報告小鼠的脾臟T細胞移植到RAG-1−/−受體小鼠體內(nèi)，并在重建期對受體小鼠進行anti-PD-1抗體處理；（E）ThPOK和Runx3的表達水平；（F）DP IELs的比例。

 

圖5G-I. （G）將CD4+ T細胞和TGF-β、RA、PD-L1體外共培養(yǎng)3天后，測定ThPOKhi細胞比例。PD-L1介導了ThPOK的表達下調；（I-H） 將CD4+ T細胞和TGF-β、RA、PD-L1、SHP抑制劑（SHPi）體外共培養(yǎng)3天后，測定DP IELs的比例以及ThPOK和Runx3的表達水平。

 

綜上，在這篇文章中，研究者們發(fā)現(xiàn)IECs是腸道中促進DP IELs分化的重要調控因素，起到了非典型APC的作用。腸道微生物群產(chǎn)生的IFN-γ可通過刺激IECs表達MHC II和PD-L1，對SP IELs提供TCR刺激和共受體信號，促進其向DP IELs分化。此外，研究者們還發(fā)現(xiàn)不同生理位置的IECs的基因表達譜會有所區(qū)別，而這也會影響它們周圍的組織駐留型免疫細胞（例如DP IELs的分化）。

注：文中所有小鼠均為C57BL/6遺傳背景

 

人體腸道微生物基因組作為人類的第二套基因組，與人類健康密切相關。大量的研究表明腸道微生物與包括心血管、腫瘤、免疫、神經(jīng)、消化等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，其因果關系也在逐步闡明中。